曹 波 付 剛 王曉敏 柴春香 張兆光 陳學(xué)勛

1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，山東濰坊 261041；2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院泌尿外科，山東青州 262500；3.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院病理科，山東青州 262500；4.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院超聲科，山東濰坊 261041；5.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，山東濰坊 261041

腎細(xì)胞癌（RCC）是成年人腎臟惡性腫瘤的最常見類型，起源于近曲小管，所占比例約90%[1-2]。手術(shù)治療是首選治療方法，RCC的5年存活率可達(dá)到65%～90%[1]。當(dāng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，或者因其他疾病失去手術(shù)機(jī)會(huì)時(shí)，存活率大大降低，因此積極探索晚期RCC 有效治療藥物成為研究熱點(diǎn)。PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的激活在腎癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲中起到重要的作用[3-8]。雷公藤甲素是雷公藤植物的有效成分提取物，可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、干擾腫瘤細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成，從而達(dá)到抗腫瘤的效果[9-10]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可通過PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路抑制卵巢癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲[11-13]，而在腎細(xì)胞癌中的作用鮮有報(bào)道。本研究探討雷公藤甲素通過PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路對(duì)腎癌A498細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，旨在為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

腎癌A498細(xì)胞（ATCC 細(xì)胞庫）；雷公藤甲素（美國sigma 公司）；β-actin、AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)公司）；MTT 試劑盒（北京普洛麥格生物技術(shù)公司）；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、5×SDS 蛋白上樣緩沖液、二甲基亞砜及牛血清白蛋白（廣州碧云天生物技術(shù)研究所）；ECL 試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；Transwell 小室（美國Corning 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系和培養(yǎng)環(huán)境 A498細(xì)胞在含10%FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雷公藤甲素配置：將1 mg 雷公藤甲素加入3.47 mL的二甲基亞砜中溶解，再加入0.9%的無菌生理鹽水稀釋成相應(yīng)終濃度的雷公藤甲素，過濾膜過濾后再分裝至EP 管，放在-20℃冰箱中備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 經(jīng)雷公藤甲素濃度（0、0.1、0.5、1、5、10、50 μmol/L）篩選實(shí)驗(yàn)后，確定IC50，根據(jù)IC50確定雷公藤甲素相對(duì)最佳劑量，共分為3組：對(duì)照組為雷公藤甲素0 nmol/L、低劑量組為雷公藤甲素200 nmol/L、高劑量組為雷公藤甲素400 nmol/L。

1.2.3 Western Blot 細(xì)胞在RIPA 裂解液中4℃下裂解20 min，之后細(xì)胞裂解液10 000 g 下離心10 min清除雜物，蛋白濃度通過BCA 進(jìn)行測定。裝載樣品并在10%SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳分離，之后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，膜在5%牛血清白蛋白（BSA）室溫下封閉1 h，與原抗體分別在4℃過夜。TBS-tween 三次洗滌后，進(jìn)一步在室溫下與羊抗兔或羊抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)1 h。蛋白檢測采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒，條帶密度通過Quantity One 軟件進(jìn)行測定。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板與多孔聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯膜（8 μm 孔徑）分別用于檢測細(xì)胞侵襲能力。上層培養(yǎng)板為覆膜膠，然后接種5×105活細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基。下層培養(yǎng)基中添加20%FBS 作為趨化因子。37℃下培養(yǎng)16 h后，細(xì)胞侵襲至膜的下面，用PBS 沖洗，甲醇固定和水晶藍(lán)染色。在7個(gè)隨機(jī)域的光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 通過24 孔板細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行分析。上室接種5×105活細(xì)胞，下室充滿了含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中作為趨化因子。37℃下培養(yǎng)16 h后，穿過膜的細(xì)胞用PBS 沖洗，甲醇固定和水晶藍(lán)染色。在7個(gè)隨機(jī)域的光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，密度為0.3×103個(gè)/孔。細(xì)胞培養(yǎng)8 h后，每24小時(shí)加入不同濃度的雷公藤甲素。在48 h 加入MTT。細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)4 h后完全去除培養(yǎng)基。然后每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液。在黑暗下?lián)u晃15 min，然后用酶標(biāo)儀測定在490 nm 處細(xì)胞的光密度（optical density，OD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組AKT、p-AKT、MTOR 和p-MTOR蛋白表達(dá)情況的比較

高劑量組、低劑量組的p-AKT、p-MTOR表達(dá)均低于對(duì)照組，高劑量組的p-AKT、p-MTOR表達(dá)低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三組的AKT和MTOR蛋白比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1、表1）。

圖1 三組AKT、p-AKT、MTOR 和p-MTOR蛋白的表達(dá)情況

表1 三組AKT、p-AKT、MTOR 和p-MTOR蛋白表達(dá)情況的比較（）

表1 三組AKT、p-AKT、MTOR 和p-MTOR蛋白表達(dá)情況的比較（）

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

組別 AKT p-AKT MTOR p-MTOR對(duì)照組低劑量組高劑量組1.56±0.15 1.39±0.14 1.32±0.16 0.96±0.09 0.56±0.07a 0.35±0.06ab 1.13±0.09 1.06±0.07 0.99±0.07 0.91±0.08 0.53±0.05a 0.32±0.03ab

2.2 三組不同時(shí)間點(diǎn)OD值的比較

高劑量組、低劑量組24、48、72 h的OD值低于對(duì)照組，高劑量組24、48、72 h的OD值低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組、低劑量組、高劑量組48、72 h的OD值均高于24 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 三組不同時(shí)間點(diǎn)OD值的比較（）

表2 三組不同時(shí)間點(diǎn)OD值的比較（）

與對(duì)照組同期比較，aP＜0.05；與低劑量組同期比較，bP＜0.05；與本組24 h 比較，cP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組低劑量組高劑量組0.56±0.10 0.25±0.06a 0.11±0.04ab 0.78±0.15c 0.42±0.07ac 0.22±0.04abc 0.93±0.16c 0.61±0.08ac 0.42±0.07abc

2.3 三組細(xì)胞遷移、侵襲能力的比較

高劑量組、低劑量組的細(xì)胞遷移、侵襲能力均低于對(duì)照組，高劑量組的細(xì)胞遷移、侵襲能力低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 三組細(xì)胞遷移、侵襲能力的比較（個(gè)/視野，）

表3 三組細(xì)胞遷移、侵襲能力的比較（個(gè)/視野，）

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

組別 細(xì)胞遷移 穿膜細(xì)胞數(shù)對(duì)照組低劑量組高劑量組23.50±5.38 11.60±3.24a 6.43±1.05ab 94.32±4.12 58.18±3.36a 25.54±3.47ab

3 討論

RCC是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病較隱匿，且侵襲性較強(qiáng)，多數(shù)發(fā)展到晚期才被發(fā)現(xiàn)[1-2]。因?qū)Ψ暖熀突煹缺Ｊ匦灾委煵幻舾?，外科手術(shù)仍是最佳的治療方法，雖然聯(lián)合新輔助性化療方案取得較好的療效，但是患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍較高[1-2，14]。近期研究發(fā)現(xiàn)，靶向藥物具有精準(zhǔn)治療及全身副作用少的優(yōu)勢，成為晚期腎細(xì)胞癌的主要治療手段之一，為晚期患者提供更有效的治方案，從而提高患者的生存期和生存質(zhì)量[3，15-16]。

PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路在細(xì)胞中廣泛存在，并參與細(xì)胞的增殖、凋亡及血管生成等[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的激活與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，針對(duì)此信號(hào)通路的分子靶向治療成為目前研究的熱點(diǎn)[15-18]，通過抑制PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的激活，可以降低肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌等多種癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力[19-24]。有研究運(yùn)用PI3K/MTOR 雙重阻斷劑NVP-BEZ235 體外處理腎癌A498細(xì)胞系，明顯抑制腎癌A498細(xì)胞系中磷酸化蛋白p-AKT 和p-MTOR的表達(dá)，從而抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[4]。前期研究表明，激活PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路，可促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲。以上研究充分說明PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路在腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中起到重要的作用[8]。

雷公藤甲素是傳統(tǒng)中藥雷公藤的提取物，自發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素有抗腫瘤作用后，諸多研究通過多途徑多通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、干擾腫瘤細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成，從而達(dá)到抗腫瘤的效果[9]。閻瑋蘭[11]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素通過抑制MV411 細(xì)胞PI3KAKT-mTOR 通路蛋白的表達(dá)，從而抑制MV411 細(xì)胞的增殖。王昊等[12]同樣發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對(duì)TM4 細(xì)胞氧化應(yīng)激及PI3K/AKT 通路有明顯抑制作用。白俊等[13]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素通過PI3K/AKT/mTOR 通路誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞自噬。以上研究均評(píng)價(jià)了雷公藤甲素通過影響PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞起到抑制作用，而在腎細(xì)胞癌中報(bào)道少見[11-13]。本研究通過檢測AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR表達(dá)情況來評(píng)價(jià)雷公藤甲素對(duì)其影響，從而明確雷公藤甲素是否通過該通路起到抗腫瘤的作用，結(jié)果顯示，高劑量組、低劑量組的p-AKT、p-MTOR表達(dá)均低于對(duì)照組，高劑量組的p-AKT、p-MTOR表達(dá)低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示雷公藤甲素可以抑制腎癌A498細(xì)胞系中PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的激活。細(xì)胞增殖、遷移和侵襲是腎癌發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)特性[1-3，8]，也是腫瘤治療的難點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，高劑量組、低劑量組24、48、72 h的OD值低于對(duì)照組，高劑量組24、48、72 h的OD值低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移與預(yù)后關(guān)系密切，是影響抗腫瘤治療效果的關(guān)鍵因素之一[1-2，8]。通過對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示高劑量組、低劑量組的細(xì)胞遷移、侵襲能力均低于對(duì)照組，高劑量組的細(xì)胞遷移、侵襲能力低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示雷公藤甲素通過抑制PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的激活，從而抑制腎癌A498細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，與以往報(bào)道一致[10-13]。

綜上所述，雷公藤甲素可通過抑制PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路，從而抑制腎癌A498細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為今后腎癌細(xì)胞藥物治療及具體機(jī)制研究提供理論思路。