賴譜富，李怡彬，翁敏劼，湯葆莎，吳俐，陳君琛

摘要：利用響應(yīng)面法對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度為自變量，黃酮類化合物得率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法研究各自變量交互作用及其對黃酮類化合物得率的影響，模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型。結(jié)果表明：海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物最佳提取工藝條件為料液比1∶28、提取溫度50℃、提取時(shí)間14 h、乙醇濃度58%、振蕩速率120 r·min-1，在此工藝條件下黃酮類化合物得率為341 mg·g-1。

關(guān)鍵詞：海鮮菇;副產(chǎn)物;黃酮類化合物;提取;響應(yīng)面法

中圖分類號：TS 2555 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：0253-2301（2021）02-0001-06

DOI： 1013651/jcnkifjnykj202102001

Optimization of Extraction Process for Flavonoids from the Byproducts of

Hypsizygus Marmoreus by Response Surface Methodology

LAI Pufu， LI Yibin， WENG Minjie， TANG Baosha， WU Li， CHEN Junchen

（Research Institute of AgriEngineering Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences/Agricultural

Product Processing Research Centre， Fujian Academy of Agricultural Sciences/National R & D Center For

Edible Fungi Processing Technology， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： The response surface methodology was used to optimize the extraction process of flavonoids from the byproducts of Hypsizygus marmoreus. On the basis of the single factor experiment， the solidliquid ratio， extraction temperature， extraction time and ethanol concentration were selected as the independent variables， and the yield of flavonoids was selected as the response value. Then， the interaction of each independent variable and its effect on the yield of flavonoids were studied by using the response surface method， and the prediction model of quadratic polynomial regression equation was obtained by simulation. The results showed that the optimal extraction conditions of the flavonoids from the byproducts of Hypsizygus marmoreus were as follows： the solidliquid ratio of 1∶28， extraction temperature of 50℃， extraction time of 14 h， ethanol concentration of 58%， and oscillation rate of 120 r·min-1. Under these conditions， the yield of the flavonoids was 341 mg·g-1.

Key words： Hypsizygus marmoreus; Byproduct; Flavonoids; Extraction; Response surface methodology

海鮮菇Hypsizygus marmoreus又名蟹味菇、真姬菇，富含蛋白質(zhì)、黃酮、多糖、酚類以及微量元素等成分，具有抗氧化、消炎、抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等功效＼[1-3＼]，其在采收加工過程會(huì)產(chǎn)生5%～10%的副產(chǎn)物，當(dāng)前大部分當(dāng)作垃圾直接丟棄，既浪費(fèi)資源又對人居環(huán)境造成污染＼[4＼]。目前關(guān)于海鮮菇副產(chǎn)物的營養(yǎng)品質(zhì)，相關(guān)學(xué)者也進(jìn)行了一些研究，林忠寧等＼[4＼]研究發(fā)現(xiàn)，真姬菇菇腳和菌糠蛋白質(zhì)中總氨基酸含量為7150%和6592%，氨基酸種類齊全，具有較高的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值;于洪超等＼[5＼]研究發(fā)現(xiàn)，真姬菇菌腳的多糖、總酚、黃酮、灰分及粗纖維等含量是子實(shí)體的142、102、121、115、169倍，開發(fā)利用價(jià)值較好;王麗等＼[6＼]研究發(fā)現(xiàn)，海鮮菇的蓋、柄、根、幼菇及殘菇中必需氨基酸模式與人體要求較接近，與其他食物營養(yǎng)搭配可提高營養(yǎng)價(jià)值;陶明煊等＼[7＼]研究發(fā)現(xiàn)，真姬菇菌柄中多糖、蛋白質(zhì)含量均高于菌蓋，其多糖清除超氧自由基和羥自由基能力較強(qiáng)。

黃酮類化合物在自然界廣泛分布，因其毒性低、藥理活性強(qiáng)等，在化妝品、醫(yī)藥、食品等工業(yè)中應(yīng)用廣泛＼[8＼]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對黃酮物質(zhì)的提取已有眾多研究，主要有水提取法、超聲波提取法、有機(jī)溶劑提取法、生物酶解提取法、超臨界萃取法、微波提取法、大孔樹脂吸附法、加壓流體提取法等＼[9-10＼]，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。呂鵬濤等＼[11＼]以工廠化海鮮菇菇根為原料，采用超聲波輔助法提取總黃酮，總黃酮提取含量可達(dá)2178 mg·g-1;黃敏＼[12＼]研究蟹味菇總黃酮的超聲提取工藝條件，在料液比1∶40、75%乙醇、70℃下超聲提取20 min，總黃酮含量達(dá)0061%，但未見以海鮮菇副產(chǎn)物為原料提取黃酮類化合物的報(bào)道。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，選用乙醇振蕩法對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)探討黃酮類化合物得率受液料比、提取溫度、提取時(shí)間及乙醇濃度影響的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法對主要影響因素水平進(jìn)行優(yōu)化，為海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取的產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1材料與方法

11材料與試劑

賴譜富等：響應(yīng)面優(yōu)化海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取工藝2021年第2期2021年第2期賴譜富等：響應(yīng)面優(yōu)化海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取工藝海鮮菇副產(chǎn)物系正常生長110～120 d后，采收分揀時(shí)未達(dá)到商品海鮮菇規(guī)格的小菇（菌蓋直徑小于15 cm，菌柄長度小于4 cm），由福建省同興菌業(yè)有限責(zé)任公司提供。新鮮海鮮菇副產(chǎn)物清洗后60℃熱泵烘干，含水率為82%左右。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、三氯化鋁、無水乙醇、醋酸鉀均為分析純。

12儀器與設(shè)備

BS2000S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）; SP756P型紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）;RE501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;DLK2020型低溫冷卻循環(huán)泵（寧波新芝生物科技股份有限公司）;粉碎機(jī)（江蘇常州宇通干燥設(shè)備有限公司）;SPH103B型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

13試驗(yàn)方法

131工藝流程海鮮菇副產(chǎn)物→60℃條件下熱泵烘干→粉碎后過50目篩→乙醇振蕩法提取（振蕩速率120 r·min-1）→測定黃酮類化合物得率。

132海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物的測定采用蘆丁比色法＼[13＼]。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。分別精確移取0、1、2、3、4、5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于50 mL帶塞比色管中，由于最后定容為15 mL，相當(dāng)于0、03、06、09、12、15 mg的蘆丁質(zhì)量。于標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入2 mL 三氯化鋁溶液混勻，各加入2 mL醋酸鉀溶液混勻，加入30%乙醇定容至15 mL，混勻，靜置10～15 min，最后于415 nm處測定吸光值（B）。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度A為橫坐標(biāo)，吸光度值B為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過線性回歸，得到回歸方程B=05885A+00078，R2=09991。

（2）海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物的測定。精密吸取海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物樣品溶液10 mL置于50 mL帶塞玻璃比色管中，按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定黃酮類化合物含量，根據(jù)下列公式計(jì)算得率。

黃酮類化合物得率X=A/（m×V1/V2）

式中：X為試驗(yàn)中黃酮類化合物含量（以蘆丁計(jì)），mg·g-1;m為試樣的質(zhì)量，g;A為測定用樣液中蘆丁的質(zhì)量，mg;V1為測定用樣液的體積，mL;V2為試樣處理液的總體積，mL。

14試驗(yàn)設(shè)計(jì)

141海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取單因素試驗(yàn)（1）料液比對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響。按料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35分別加入60%的乙醇，在120 r·min-1、50℃下振蕩提取15 h，每個(gè)試驗(yàn)提取1次，重復(fù)2次。探討海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物的得率受料液比的影響。（2）提取溫度對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響。按料液比1∶25加入60%乙醇，分別在溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下120 r·min-1振蕩提取15 h，每個(gè)試驗(yàn)提取1次，重復(fù)2次。探討海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物的得率受提取溫度的影響。（3）提取時(shí)間對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響。按料液比1∶25加入60%乙醇，在50℃、120 r·min-1下分別振蕩提取05、10、15、20、25 h，每個(gè)試驗(yàn)提取1次，重復(fù)2次。探討海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物的得率受提取時(shí)間的影響。（4）乙醇濃度對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響。按料液比1∶25分別加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，在50℃、120 r·min-1下振蕩提取15 h，每個(gè)試驗(yàn)提取1次，重復(fù)2次。探討海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物的得率受乙醇濃度的影響。

142海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)根據(jù)BoxBenhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取影響海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的主要影響因素料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）及乙醇濃度（X4）為試驗(yàn)因素，以黃酮類化合物得率為響應(yīng)值，進(jìn)行4 因素3 水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取工藝條件。因素水平編碼見表1。

15數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DesignerExpertV 8061對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

2結(jié)果與分析

21單因素試驗(yàn)結(jié)果

211料液比對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響從圖1可知，隨著料液比的增大，海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率先增大后減小，料液比為1∶25～1∶30的增幅趨勢比1∶15～1∶25的趨勢稍大，料液比1∶30后得率變小。這可能是因?yàn)楹ｕr菇副產(chǎn)物與乙醇的直接接觸面積隨著料液比的增大而增加，黃酮類化合物成分也隨之更多溶解出來，但是當(dāng)料液比超過1∶30時(shí)，雜質(zhì)的溶出也隨之增大，進(jìn)而導(dǎo)致黃酮類化合物得率減?。躘14＼]。

212提取溫度對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響由圖2可知，隨著溫度的提高，海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率先增大后減小，在40～50℃增加幅度較大，之后呈緩慢下降趨勢。一般來說，溫度越高黃酮類化合物成分的溶出速率越快，但溫度過高也會(huì)造成黃酮類化合物得率下降，這可能是因?yàn)楦邷仄茐牧撕ｕr菇副產(chǎn)物黃酮類化合物，且高溫直接增加雜質(zhì)的溶出，干擾黃酮類化合物含量的測定。

213提取時(shí)間對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響圖3表明，提取時(shí)間在05～15 h，海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物的得率呈上升趨勢，15 h后黃酮類化合物得率有所下降。這可能是因?yàn)辄S酮類化合物成分在短時(shí)間內(nèi)未充分溶出，其溶出率隨著提取時(shí)間的延長而增加，但黃酮類化合物組分在過長提取時(shí)間下會(huì)被破壞，從而導(dǎo)致得率降低＼[14＼]。

214乙醇濃度對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響從圖4可以看出，隨著乙醇濃度的增大，海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率先增大后減小，乙醇濃度60%時(shí)得率最大。這可能是因?yàn)楹ｕr菇副產(chǎn)物黃酮類化合物的極性與60%乙醇的極性相似，同時(shí)脂溶性物質(zhì)會(huì)隨著乙醇濃度的升高而加速溶出，進(jìn)而導(dǎo)致黃酮類化合物得率降低＼[15＼]。

22響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。經(jīng)多元回歸分析可知，各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，經(jīng)回歸擬合后，得到各因素與綜合值之間的多元二次回歸方程。

Y=328-021X1-0009X2-016X3-021X4-011X1X2+0018X1X3-011X1X4-016X2X3-0085X2X4-021X3X4-031X12-070X22-031X32-040X42

221回歸模型方差分析由表3可知，響應(yīng)值Y（得率）回歸模型高度顯著（P<00001），一次項(xiàng)X1（料液比）、X3（提取時(shí)間）、X4（乙醇濃度）對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響差異均極顯著（P<001），X2（提取溫度）不顯著;二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響差異均極顯著（P<001）;交互項(xiàng)中只有X3X4對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響差異顯著（P<005），其他交互項(xiàng)均不顯著。4個(gè)因素對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響主次順序?yàn)椋篨4（乙醇濃度）>X1（料液比）>X3（提取時(shí)間）>X2（提取溫度）。

對二次回歸方程進(jìn)行F檢驗(yàn)和失擬性檢驗(yàn)，結(jié)果表明：模型P<00001，說明模型極顯著;失擬項(xiàng)P=00564>005，說明模型擬合程度好，可用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測。

222因素交互作用對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響由圖5可知，乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的影響差異顯著，隨著乙醇濃度的升高和提取時(shí)間的延長，海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率呈先升高后降低的趨勢，即在一定的乙醇濃度和提取時(shí)間條件下海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率具有極大值。海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率隨乙醇濃度的變化幅度大于提取時(shí)間，表明乙醇濃度對得率的影響更為顯著，這與上述單因素試驗(yàn)及方差分析的結(jié)果一致。

223海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取的工藝參數(shù)優(yōu)化與模型驗(yàn)證由回歸方程預(yù)測可得因素水平的最優(yōu)組合，并將各因素水平換算為對應(yīng)的實(shí)測值，得到海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶284、提取溫度5057℃、提取時(shí)間138 h和乙醇濃度5842%，在該條件下海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率為340 mg·g-1。考慮到實(shí)際操作可行性，將最佳工藝參數(shù)修正為：料液比1∶28、提取溫度50℃、提取時(shí)間14 h和乙醇濃度58%。根據(jù)修正的最佳工藝條件，進(jìn)行6次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測得海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物得率的均值為341 mg·g-1，與預(yù)測值基本接近，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，驗(yàn)證了該模型的可靠性，同時(shí)表明響應(yīng)曲面法適用于海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取的工藝優(yōu)化。

3結(jié)論

（1）利用響應(yīng)面分析法建立了海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物乙醇振蕩提取過程中提取溫度、乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間4個(gè)影響因素的回歸模型，并對模型進(jìn)行分析檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明響應(yīng)面法優(yōu)化海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物乙醇振蕩提取工藝可行。

（2）通過響應(yīng)面分析得出海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物最佳提取工藝條件為料液比1∶28、提取溫度50℃、提取時(shí)間14 h、乙醇濃度58%、振蕩速率120 r·min-1，在此工藝條件下黃酮類化合物得率為341 mg·g-1。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

賴譜富，李怡彬，翁敏劼，等響應(yīng)面優(yōu)化海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類化合物提取工藝＼[J＼]福建農(nóng)業(yè)科技，2021，51（2）：01-06.

優(yōu)秀學(xué)者論壇

賴譜富，1983年生，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工及功能營養(yǎng)食品開發(fā)研究，主持國家公益類行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)、國家標(biāo)準(zhǔn)制訂、福建省科技計(jì)劃、福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系等項(xiàng)目23項(xiàng)，獲福建省科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)2項(xiàng)（排名第3、4）、三等獎(jiǎng)5項(xiàng)（排名第1、2、4各1項(xiàng)，2項(xiàng)排名第3），授權(quán)國家發(fā)明專利24項(xiàng)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文53篇，其中6篇獲中國農(nóng)學(xué)會(huì)優(yōu)秀論文、福建省自然科學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)論文獎(jiǎng)?，F(xiàn)任福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所副所長、福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系加工崗位專家、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)首席專家，入選福建省首屆青年托舉人才工程、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科技英才百人計(jì)劃等。

收稿日期：2021-01-25

作者簡介：賴譜富，男，1983年生，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工研究。

*通信作者：陳君琛，男，1959年生，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及功能營養(yǎng)研究（Email：junchencc@sinacom）。

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFD0400203）;福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2019R1032-10）;福建省現(xiàn)代食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（閩財(cái)指〔2019〕897號）;福建省財(cái)政專項(xiàng)——福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（STIT2017-3-5）。響應(yīng)面優(yōu)化海鮮菇副產(chǎn)物黃酮類