楊爍 燕玉敏

1. 274300菏澤, 單縣中心醫(yī)院口腔內(nèi)科； 2. 濱州市中醫(yī)院口腔科

隨著人們生活水平的提高，對(duì)正畸的需求也不斷擴(kuò)大。正畸治療是通過(guò)移動(dòng)牙齒矯正錯(cuò)畸形，這一過(guò)程包括受正畸力的牙槽骨和牙周膜組織改建[1]。牙移動(dòng)伴隨根吸收作為正畸常見的并發(fā)癥，其發(fā)生概率可達(dá)3%～100%[2]。因此，提高矯正效率的同時(shí)保持矯正后的穩(wěn)定性顯得尤為重要。異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)是β腎上腺素受體激動(dòng)劑，有研究表明，交感神經(jīng)系統(tǒng)可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活動(dòng)，在骨的生理和病理變化中起到重要作用[3]。本研究通過(guò)大鼠正畸牙移動(dòng)模型的建立，探討ISO對(duì)大鼠正畸牙移動(dòng)效果及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2， Runx2)、 破骨細(xì)胞分化因子(Osteoclast differentiation factor， ODF)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽酸異丙腎上腺素、戊巴比妥鈉(西格瑪奧德里奇中國(guó)有限公司)；EDTA脫鈣液(上海舜百生物)；抗酒石酸酸性磷酸酯酶試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；鎳鈦拉簧(杭州新齒科材料有限公司)；正畸測(cè)力計(jì)(杭州奧索醫(yī)療器械有限公司); 游標(biāo)卡尺(廣州儀表儀器有限公司)；顯微鏡(Olympus，日本)；Runx2、ODF抗體(Abcam公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠40只(購(gòu)自華東師范大學(xué)，使用許可證號(hào)SYXK(滬)2015-0025)，體重約(200±20) g，自由飲食、飲水，溫度(25±1) ℃，濕度(60±10)%。

1.3 動(dòng)物模型的建立和治療方法

1%戊巴比妥鈉腹腔注射大鼠，待麻醉后于大鼠右上頜第一磨牙和切牙用快速渦輪機(jī)將固位溝磨出(深約1 mm)，在右上第一、二磨牙之間穿過(guò)正畸不銹鋼結(jié)扎絲(約0.02 mm)，將鎳鈦拉簧一端固定，正畸測(cè)力計(jì)測(cè)出50 g彈簧力值的距離，將拉簧的另一端用不銹鋼絲結(jié)扎固定于切牙的固位溝。每日檢查并維持加力裝置。按隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組和ISO組，各20 只。ISO組腹腔注射5 mg/(kg·d)的ISO，對(duì)照組給予等體積的生理鹽水， 1 次/d， 連續(xù)給藥21 d。

1.4 測(cè)量牙齒移動(dòng)距離

分別于0、 7、 14、 21 d通過(guò)大鼠腹腔注射過(guò)量1%戊巴比妥鈉(10 mg/100 g)處死大鼠(每組5 只)，剪下大鼠上頜頜骨，去除周圍軟組織，采用游標(biāo)卡尺測(cè)定測(cè)量大鼠左上頜第一、二磨牙近中頰溝點(diǎn)間的距離，兩數(shù)值差值為大鼠右上第一磨牙近中移動(dòng)距離。

1.5 標(biāo)本制作

分批處死2 組大鼠后，將右上頜第一磨牙及周圍頜骨完整取出，置于4%多聚甲醛固定， 24 h后取出，于4 ℃的EDTA脫鈣液中脫鈣6 周，取出后梯度乙醇脫水，包埋，沿牙體長(zhǎng)軸切片，厚度為3 μm。HE染色后，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 破骨細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)

選擇2 組不同時(shí)間點(diǎn)的切片各5 張，根據(jù)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒進(jìn)行TRAP染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)Howship陷窩內(nèi)細(xì)胞核數(shù)量≥3、陽(yáng)性的多核破骨細(xì)胞，取平均值。

1.7 免疫組化法檢測(cè)Runx2和ODF水平

切片脫蠟，微波修復(fù)后置于pH=6的枸櫞酸鹽緩沖液中，取出后加入一抗， 4 ℃過(guò)夜，沖洗后加入二抗， 37 ℃ 30 min，沖洗后辣根過(guò)氧化物酶顯色，蘇木素復(fù)染，脫水后中性樹膠封片，觀察各組Runx2和ODF水平變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 2 組大鼠牙齒的移動(dòng)距離

與加力前相比， 2 組大鼠的牙齒均明顯移動(dòng)，且ISO組大鼠不同時(shí)間的牙齒移動(dòng)距離顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)(表 1)。

表 1 2 組大鼠牙齒的移動(dòng)距離比較

2.2 HE染色結(jié)果

ISO組在0 d (即對(duì)照組) 時(shí)牙周膜形態(tài)較好， 牙槽骨未見明顯骨吸收，牙根兩側(cè)可見相同寬度的牙周膜；ISO組7、 14、 21 d壓力側(cè)可見破骨細(xì)胞，牙周膜變窄，牙槽骨表面存在骨吸收陷窩，張力側(cè)可見牙周膜變寬(圖 1)。

A： 0 d(對(duì)照組)； B～D： ISO組正畸開始第7、 14、 21 天

2.3 破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

2 組大鼠破骨細(xì)胞在0 d時(shí)數(shù)目較少， 7、 14 d和21 d 時(shí)2 組大鼠右上頜第一磨牙壓力側(cè)顯示較多的破骨細(xì)胞，其中ISO組破骨細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表 2)。

2.4 Runx2 和ODF表達(dá)水平

2 組大鼠牙周膜中Runx2表達(dá)水平明顯升高，其中ISO組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)； 2 組大鼠牙周膜中ODF表達(dá)水平明顯升高，其中ISO組明顯低于對(duì)照組(P<0.05)(表 3)。

表 2 2 組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)目

3 討 論

表 3 2 組大鼠Runx2 和ODF表達(dá)水平

表 3 2 組大鼠Runx2 和ODF表達(dá)水平

分 組0 d7 d14 d21 dRunx2ODFRunx2ODFRunx2ODFRunx2ODF對(duì)照組21.01±0.4713.70±1.0122.82±0.2117.28±0.4523.89±0.2320.38±0.3125.01±0.3122.18±0.40ISO組21.01±0.4713.70±1.0123.39±0.2415.03±0.3025.73±0.2817.19±0.2227.79±0.4019.37±0.33t值0.0000.0003.0159.30311.35518.76512.28412.117P值1.0001.0000.0170.0000.0000.0000.0000.000

Runx2 是一種特異性的成骨標(biāo)志物，在轉(zhuǎn)錄水平參與了骨組織的多種特異性蛋白調(diào)控，并在成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化過(guò)程中起中要作用[7]。周璨等人的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠正畸過(guò)程中牙周組織的成骨細(xì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞中存在Runx2的表達(dá)，并且參與了牙周組織的改建過(guò)程[8]。有研究顯示，在Runx2缺失的小鼠骨骼細(xì)胞中，可能通過(guò)對(duì)ODF表達(dá)水平的調(diào)節(jié)參與形成破骨細(xì)胞[9]。ODF是破骨細(xì)胞抑制因子/骨保護(hù)素的一種配體，牙周組織細(xì)胞中ODF的表達(dá)與破骨細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)[10]。為探討ISO在大鼠正畸治療過(guò)程中的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了ISO作用后大鼠牙周組織中的Runx2和ODF的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，加力后兩組大鼠牙周膜中Runx2表達(dá)水平明顯升高、ODF表達(dá)水平明顯升高，但 ISO組的Runx2表達(dá)水平高于對(duì)照組，ODF表達(dá)水平低于對(duì)照組，其可能原因是ISO通過(guò)促進(jìn)牙周組織的Runx2、抑制ODF表達(dá)水平，抑制了正畸牙移動(dòng)過(guò)程中破骨細(xì)胞的生成、活化和骨吸收這些關(guān)鍵步驟，影響了大鼠正畸牙的移動(dòng)速度。

綜上所述，異丙腎上腺素可促進(jìn)大鼠正畸牙移動(dòng)，并影響Runx2和ODF的表達(dá)水平。但在長(zhǎng)期的正畸治療過(guò)程中，ISO的安全性和有效性還有待進(jìn)一步的研究。