吳侃 徐曉 張敏娜 楊邵瑜 李鑫 朱魯程 王冰 湯藝 夏冰 陳雪琴 馬勝林*

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一［1］，近年來以程序化細(xì)胞死亡受體1（PD1）或程序化細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）抑制劑為代表的免疫治療已成為繼化療、靶向治療之后重要的系統(tǒng)性治療方法［2-3］。既往研究發(fā)現(xiàn)各種潛在的免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物，如PD-L1［4］、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）［5］，腸道微生物［6］、乳酸脫氫酶［7］、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值［8］等，但仍存在檢測平臺和抗體的差異、截斷值不明確、檢測成本較高等問題。因此，開發(fā)便捷、經(jīng)濟(jì)、適用范圍廣的療效預(yù)測手段是目前重要的研究方向。本文擬通過回顧性分析經(jīng)免疫治療的晚期肺癌患者臨床特征包括基線細(xì)胞免疫功能與療效的相關(guān)性，尋找可能的療效預(yù)測因子。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2017年1月至2020年12月本院84例接受免疫檢查點抑制劑治療的晚期肺癌患者臨床資料，其中男70例，女14例；年齡36～85歲，中位年齡65歲。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①Ⅳ期；②接受PD1或PD-L1免疫治療；③接受免疫治療≥6個月或已出現(xiàn)免疫疾病完全緩解（iCR）/免疫疾病進(jìn)展（iPD）；④具有完整的臨床資料；⑤免疫治療前1周內(nèi)均有完整的細(xì)胞免疫功能檢驗記錄；⑥能獲取最佳療效評估結(jié)果。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①病歷資料不完整；②早期或局部晚期患者。療效評價依據(jù)《免疫治療實體瘤反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)（iRECIST）1.1版》分為iCR、免疫部分緩解（iPR）、免疫疾病穩(wěn)定（iSD）和iPD。

1.2 治療方法 納入患者均接受PD1或PD-L1免疫 治 療，PD1藥 物 包 括Pembrolizumab、Nivolumab、Durvalumab、信迪利單抗、特瑞普利單抗、卡瑞麗珠單抗；PD-L1藥物包括Atezolizumab和CS1001；藥物劑量參考藥物說明書或臨床研究方案。其中，單用免疫治療50例，聯(lián)合化療或抗血管生成治療34例。化療方案包括紫杉醇/白蛋白紫杉醇聯(lián)合鉑類、培美曲塞聯(lián)合鉑類、依托泊苷聯(lián)合鉑類等，抗血管生成治療包括貝伐珠單抗、安羅替尼等。

1.3 數(shù)據(jù)評估 根據(jù)iRECIST標(biāo)準(zhǔn)對所有研究對象進(jìn)行療效評估，按隨訪最佳療效將其分為治療有效組（iCR或iPR）和治療無效組（iSD或iPD），其中未確認(rèn)的PD（iUPD）必須在首次評估后4～8周內(nèi)再次進(jìn)行影像學(xué)評估直至確認(rèn)的PD（iCPD）。

1.4 觀察指標(biāo) 采集并比較兩組患者的臨床一般資料，包括年齡、性別、KPS評分、吸煙史、病理、合并腦轉(zhuǎn)移、激素用藥史、抗生素用藥史、聯(lián)合化療/抗血管治療、PD-L1表達(dá)及治療線數(shù)。采集兩組患者免疫治療前1周內(nèi)的細(xì)胞免疫功能指標(biāo)，包括總淋巴細(xì)胞、總T細(xì)胞（CD3+）、輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞（CD3+CD4+）、抑制/細(xì)胞毒T細(xì)胞（CD3+CD8+）、CD4/CD8比值、B細(xì)胞（CD3-CD19+）、NK細(xì)胞（CD3-CD56+）、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞（CD4+CD25+）、抑制性T細(xì)胞活化（CD8+CD38+），并分析各指標(biāo)與療效的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗或U檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用卡方檢驗；雙變量相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析；多因素分析采用二元Logistic回歸分析；最佳療效聯(lián)合預(yù)測指標(biāo)的診斷價值評價采用ROC曲線分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最佳療效評估結(jié)果 評估為最佳療效的時間為52.5 d（12～186 d）。治療有效組26例，其中iCR 1例，iPR 25例，客觀緩解率31.0%；治療無效組58例，其中iSD 34例，iPD24例。

2.2 兩組患者一般資料比較 治療有效組患者激素使用率低于治療無效組（3.8% vs 25.9%，P=0.038）；一線治療較二線及以上患者有更高的客觀緩解率（57.6% vs 13.7%，P＜0.001）。見表1。

表1 兩組患者的臨床一般資料比較［n（%）］

2.3 兩組患者的細(xì)胞免疫功能指標(biāo)比較 治療有效組較治療無效組有更高的淋巴細(xì)胞總數(shù)（P=0.026）、CD3+T細(xì)胞數(shù)（P=0.010）、CD8+T細(xì)胞數(shù)（P=0.009）和更低的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞百分比（P=0.005）。見表2。

表2 兩組患者的細(xì)胞免疫功能指標(biāo)比較（±s）

表2 兩組患者的細(xì)胞免疫功能指標(biāo)比較（±s）

組別 淋巴細(xì)胞總數(shù)（M/L）CD3+T細(xì)胞（M/L）CD4+T細(xì)胞（M/L）CD8+T細(xì)胞（M/L）CD4/CD8 B細(xì)胞（M/L）NK細(xì)胞（M/L）免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞（%）抑制性T細(xì)胞活化（%）治療有效組 1319.92±585.37 932.46±458.34 400.43±255.41 459.45±302.35 1.04±0.80 123.86±124.69 240.97±147.61 5.65±1.67 17.61±7.25治療無效組 1029.14±368.18 667.01±266.45 326.84±164.39 288.33±115.07 1.23±0.52 76.07±65.00 264.59±154.87 7.15±3.10 18.79±8.38 t/Z值 2.334 2.752 1.349 2.797 1.303 1.845 0.655 2.869 0.625 P值 0.026 0.010 0.186 0.009 0.196 0.075 0.514 0.005 0.534

2.4 最佳療效相關(guān)影響因素的多元Logistic回歸分析 CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)與CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)（P＜0.001）和淋巴細(xì)胞總數(shù)（P＜0.001）均存在相關(guān)性；將單因素分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素包括治療線數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞百分比等納入多元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示治療線數(shù)（P＜0.001）及低CD8+T淋巴細(xì)胞（P=0.003）是疾病進(jìn)展的獨立危險因素，CD8+T淋巴細(xì)胞的最佳截斷值為278.8 M/L；治療有效組患者接受一線治療的比例、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)值均高于治療無效組。見圖1～3、表3。

圖1 兩組患者的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞總數(shù)和CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析

圖2 兩組患者的CD8+T淋巴細(xì)胞分布和離散趨勢，★★P＜0.01

圖3 兩組患者的治療線數(shù)分布，★★★P＜0.001

表3 最佳療效相關(guān)影響因素的多元Logistic回歸分析

2.5 治療線數(shù)與CD8+T淋巴細(xì)胞對晚期肺癌患者免疫治療最佳療效的預(yù)測能力比較 基線CD8+T淋巴細(xì)胞ROC曲線下面積為0.713，治療線數(shù)ROC曲線下面積為0.745，二者聯(lián)合ROC曲線下面積為0.853，與參考線下的面積相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），靈敏度88.2%，特異度73.3%。見圖4。

圖4 治療線段數(shù)與CD8+淋巴細(xì)胞預(yù)測晚期肺癌最佳療效ROC曲線

3 討論

近年來，PD1/PD-L1抑制劑免疫治療在NSCLC治療中取得了良好的療效，且總體耐受性良好，但部分患者仍有可能出現(xiàn)免疫相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此亟需研發(fā)有效的療效預(yù)測指標(biāo)。PD-L1、TMB等指標(biāo)與免疫治療療效相關(guān)，但由于敏感性、特異性不足等問題，臨床應(yīng)用仍存在較大局限性，本文治療有效組與治療無效組患者PD-L1表達(dá)無明顯差異，這可能與部分患者PD-L1表達(dá)狀態(tài)未知有關(guān)。單一指標(biāo)的檢測可能無法滿足臨床需求，基于多指標(biāo)的聯(lián)合預(yù)測將是重要的研究方向。

目前，對于免疫治療前接受過一線甚至多線治療的肺癌患者是否存在療效差異仍存在爭議。HERBST R S等［9］研究提示，PD1在NSCLC的后線治療中療效并不理想，Pembrolizumab單藥二線治療PD-L1陽性（≥1%）晚期NSCLC的客觀緩解率為18%，無進(jìn)展生存期為4個月。日本一項研究選取Nivolumab經(jīng)治的晚期NSCLC患者79例進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)不同線數(shù)使用免疫治療的客觀緩解率不同，2線為28.3%、3線為23.1%、4線為10.5%［10］。然而，KHOZIN S等［11］選取接受免疫治療的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者1344例進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)后線治療并不影響患者生存時間。本研究對84例晚期肺癌患者的臨床特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一線治療較二線及以上患者有更高的疾病緩解率（57.6% vs.13.7%，P＜0.001），多因素分析顯示后線治療是疾病進(jìn)展的獨立危險因素（OR=15.104，95%CI：3.890～58.646，P＜0.001）。免疫檢查點抑制劑并不直接用于殺傷腫瘤細(xì)胞，而是通過激活腫瘤患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，調(diào)動能夠識別腫瘤的免疫細(xì)胞，通過機(jī)體抗腫瘤免疫達(dá)到殺滅和控制腫瘤的效果。傳統(tǒng)抗腫瘤治療手段直接殺傷腫瘤細(xì)胞，但不可避免的也會破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，造成免疫功能低下甚至衰竭，因此后線免疫治療機(jī)體反應(yīng)不足，療效欠佳不難解釋。

既往研究顯示，機(jī)體免疫系統(tǒng)在腫瘤患者尤其是接受免疫治療的患者治療結(jié)局中發(fā)揮重要作用［12-14］。2018年《Science》一項研究報道，免疫治療有效患者有著更高密度的基線腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞和循環(huán)CD8+T以及CD4+T細(xì)胞［15］。2019年一項Meta分析納入晚期肺癌患者14,395例，發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤性CD8+T淋巴細(xì)胞的增多與預(yù)后相關(guān)，3年總生存率AUC 0.659、5年總生存率AUC 0.665［16］。一項多中心、隨機(jī)、開放III期研究Impassion130評估阿替利珠單抗聯(lián)合白蛋白紫杉醇與白蛋白紫杉醇一線治療轉(zhuǎn)移性或不可手術(shù)的局部晚期三陰性乳腺癌發(fā)現(xiàn)，瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞高表達(dá)者有較好的無進(jìn)展生存期和總生存期［17］。此外，肺癌患者外周血CD8+T細(xì)胞激活也被認(rèn)為與免疫治療療效相關(guān)［18］。盡管目前越來越多的證據(jù)表明，免疫微環(huán)境在PD1/PD-L1療效預(yù)測中具有重要價值，然而尚缺乏基線外周血免疫功能與療效相關(guān)性的研究。本研究通過比較分析患者基線細(xì)胞免疫功能指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)低CD8+T細(xì)胞是疾病進(jìn)展的獨立危險因素，多因素分析（OR=0.992，95%CI：0.987-0.997，P=0.003）維持了這一結(jié)果，提示免疫功能較差尤其是CD8+T細(xì)胞較低的患者要謹(jǐn)慎使用免疫治療，278.8M/L是一個可以參考的截斷值。為探索聯(lián)合指標(biāo)預(yù)測免疫治療療效，本研究通過Logistic回歸模型計算基線CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量與治療線數(shù)聯(lián)合預(yù)測評分，ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)聯(lián)合指標(biāo)的曲線下面積為0.853，聯(lián)合指標(biāo)達(dá)到0.517時，靈敏度為88.2%，特異度為73.3%，此時的Youden指數(shù)最大，相比單一指標(biāo)具有更高的預(yù)測價值。

綜上，本研究首次采用基線CD8+T淋巴細(xì)胞聯(lián)合治療線數(shù)預(yù)測免疫治療療效，與既往研究的治療后淋巴細(xì)胞以及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞相比，基線 CD8+T淋巴細(xì)胞可以指導(dǎo)治療并能更早地預(yù)測療效，臨床開展便捷且具有無創(chuàng)性。本研究尚存在一定的局限性，這是一項回顧性研究，且樣本量有限，有待大樣本的前瞻性研究予以驗證。