李燕 陳克龍 張妤婷 支海鴦 黎斌 孫慧靜 陳 凌*

缺血性腦卒中是最常見的一種具有較高的致殘率、致死率和復(fù)發(fā)率的腦血管疾病，且發(fā)病率逐年上升，呈年輕化趨勢［1］。及時恢復(fù)缺血區(qū)的血供以保護缺血半暗帶神經(jīng)元是治療關(guān)鍵，但腦缺血后血管再通，可導(dǎo)致缺血再灌注損傷，引起缺血及其周圍神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡，加重腦缺血損傷。改構(gòu)型酸性成纖維細(xì)胞生長因子（MaFGF）是一種多功效的生長刺激因子，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)、舒張血管、保護神經(jīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)［2］。目前研究已證實MaFGF具有良好的抗腦缺血再灌注損傷作用［3］，但其對慢性腦缺血損傷神經(jīng)保護的作用機制尚不明確。本研究通過觀察MaFGF對慢性腦缺血再灌注損傷小鼠PI3K/AKT信號通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路相關(guān)蛋白的影響，探討MaFGF的神經(jīng)保護功能及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 2～3月齡雄性C57BL/6J小鼠，體重22～25 g，購自上海斯萊克動物實驗中心，動物許可證號為SCXK（滬）2012-0002。MaFGF（暨南大學(xué)生物工程研究所），PI3K抗體（abcam，ab86714）、p-PI3K抗體（abcam，ab182651）、p-AKT抗體（abcam，ab38449）、AKT抗體（abcam，ab8805）、caspase-12抗體（abcam，ab62484）、CHOP抗體（abcam，ab11419）、GRP170抗體（abcam，ab241049），山羊抗小鼠IgG/TRITC（中杉金橋公司，貨號ZF-0313）紅光二抗、山羊抗小鼠IgG/FITC（中杉金橋公司，ZF-0312）綠光二抗，Morris水迷宮（上海吉量軟件科技公司），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（北京東勝創(chuàng)新生物科技公司），熒光顯微鏡成像系統(tǒng)（OLYMPUS公司，DP72）。

1.2 建模與分組 24只雄性C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房（室溫22±2℃，濕度50±5%）。按照隨機數(shù)字法將實驗小鼠分為Sham組、BCAO組和BCAO+MaFGF組，每組各8只。雙側(cè)頸動脈夾閉獲得腦缺血再灌注損傷模型：麻醉小鼠（10%水合氯醛），以仰臥姿勢固定于手術(shù)臺上，置于加熱毯上保持直腸溫度為37℃左右，同時保持呼吸順暢，在頸部腹側(cè)中線處常規(guī)消毒后做1 cm左右的切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，夾閉雙側(cè)頸總動脈約30 min，去除動脈夾恢復(fù)灌注，縫合切口；Sham組僅切開皮膚；再灌注后，BCAO+MaFGF組開始鼻內(nèi)給藥20 μg/kg MaFGF，其余2組給予等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)28 d。

1.3 神經(jīng)功能評估 分別于術(shù)前/術(shù)后第28天，采用神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）評估所有實驗小鼠的神經(jīng)功能損害程度，包括運動、感覺、反射、平衡試驗四個方面，分值為0～18分，小鼠無神經(jīng)功能損傷體征則評為0分。

1.4 水迷宮測試 （1）定位航行試驗：所有小鼠在給藥結(jié)束后開始訓(xùn)練，將平臺固定于目標(biāo)象限的中央，圓池中注入清水（高出平臺約2～3 cm），在4個象限各取一點作為入水口并依次放入小鼠。記錄60 s內(nèi)小鼠的運動軌跡及逃避潛伏期（從入水到爬上平臺的時間，上限為60 s）。每天在同一時間訓(xùn)練小鼠，連續(xù)訓(xùn)練5 d。（2）空間探索試驗：在訓(xùn)練第6天，移除平臺，從4個相同入水點依次放入小鼠，觀察并記錄60 s內(nèi)小鼠的運動軌跡及穿越原平臺位置次數(shù)，分析計算平均速度及在目標(biāo)象限停留的時間百分比。

1.5 樣本采集與保存 取0.9%氯化鈉溶液心臟灌注排出腦組織血液，快速斷頭，取出全腦組織，放入液氮中速凍，用于后續(xù)蛋白測定及制備冰凍切片。部分小鼠繼以4%多聚甲醛心臟灌注直至小鼠全身僵硬，取出大腦浸入4%多聚甲醛液中固定，進行石蠟包埋，切片，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Nissl染色 取石蠟切片（片厚4 μm）進行常規(guī)脫蠟、水化、洗滌，加入甲苯胺藍(lán)溶液染色（60 ℃，40 min），隨后進行脫水（梯度乙醇）、透明（二甲苯溶液）、封片（透明樹脂），光學(xué)顯微鏡下觀察各種小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。

1.7 免疫熒光染色 液氮速凍腦組織，切片機切片，片厚8 μm，35 ℃烘箱復(fù)溫5 min，4%多聚甲醛固定10 min，封閉液孵育30 min；將p-AKT、GRP170一抗稀釋液（1：100）混合后覆蓋各標(biāo)本，置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次；熒光二抗室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌；最后DAPI孵育5 min，PBS洗滌，抗熒光猝滅劑封片；熒光顯微鏡下，隨機選取5個視野，觀察各組小鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元p-AKT及GRP170的表達(dá)及位置情況，并拍照。所有步驟均在黑暗中進行。

1.8 Western blot RIPA組織裂解液裂解海馬組織細(xì)胞，提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，制備蛋白樣品。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將各組蛋白樣品中不同分子大小的蛋白分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉(zhuǎn)膜完成后脫脂奶粉室溫封閉1 h。隨后一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，滴加二抗稀釋液室溫孵育2 h，最后條帶滴加ECL化學(xué)曝光液，通過Bio-rad曝光機顯色曝光，采用ImageJ分析各蛋白灰度值，比較各組小鼠大腦海馬區(qū)p-PI3K、p-AKT、caspase-12、CHOP、GRP170的蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的mNSS評分比較 各組小鼠術(shù)前mNSS評分均為0分，表明術(shù)前各組小鼠的神經(jīng)功能均正常；術(shù)后Sham組小鼠評分為0分，BCAO組小鼠mNSS評分與Sham組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；給予MaFGF治療后，BCAO+MaFGF組小鼠mNSS評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠認(rèn)知行為能力比較 在定位航行試驗中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組小鼠的逃避潛伏期逐漸降低。在訓(xùn)練第3天，與Sham組比較，BCAO組小鼠逃避潛伏期明顯下降（P＜0.05）；與BCAO組比較，MaFGF組小鼠逃避潛伏期均明顯縮短（P＜0.05）。在空間探索試驗中，BCAO組小鼠平均穿越平臺次數(shù)與Sham組比較明顯減少（P＜0.05）；MaFGF組平均穿越平臺次數(shù)及60 s內(nèi)在原平臺象限停留的時間百分比與BCAO組比較明顯增加（P＜0.05）。見圖2。

圖1 術(shù)后各組小鼠mNSS評分結(jié)果。與Sham組比較，★P＜0.05；與BCAO組比較，# P＜0.05

圖2 A 各組小鼠在定位航行試驗中訓(xùn)練第5天的運動軌跡；B 各組小鼠在空間探索實驗中穿越平臺的運動軌跡；C 各組小鼠逃避潛伏期變化趨勢及空間探索實驗結(jié)果，包含平均速度（cm/s）、穿越平臺次數(shù)（times）和目標(biāo)象限時間（s）；與Sham組比較，★ P＜0.05；與BCAO組比較，# P＜0.05

2.3 各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化 Nissl染色顯示，Sham組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞呈圓形或錐體形，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核飽滿，核仁明顯，胞漿呈深藍(lán)色，內(nèi)含豐富的尼氏體；與Sham組比較，BCAO組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂、疏松，可見大量細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞核固縮、碎裂，壞死細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P＜0.05）；與BCAO組比較，BCAO+MaFGF組小鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元細(xì)胞增多，壞死細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞Nissl染色（×200）；與Sham組比較，★ P＜0.05；與BCAO組比較，# P＜0.05

2.4 各組小鼠海馬區(qū)p-PI3K、p-AKT、GRP170、CHOP、caspase-12蛋白表達(dá)水平比較 BCAO組小鼠海馬內(nèi)CHOP和caspase-12與Sham組相比明顯升高（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、GRP170均未見明顯改變（P＞0.05）；經(jīng)MaFGF處理后，CHOP和Caspase-12明顯降低，而p-PI3K、p-AKT、GRP170表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組小鼠海馬CA1區(qū)p-PI3K、p-AKT、GRP170、Caspase-12、CHOP蛋白表達(dá)水平比較；與Sham組比較，★ P＜0.05；與BCAO組比較，# P＜0.05

2.5 各組小鼠海馬區(qū)p-AKT、GRP170免疫陽性顆粒的表達(dá)情況 p-AKT和GRP170免疫陽性顆粒均聚集在海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)；BCAO組小鼠海馬區(qū)p-AKT和GRP170免疫陽性顆粒表達(dá)量與Sham組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；GRP170和p-AKT在BCAO+MaFGF組的分布均比BCAO組更趨致密。見圖5。

3 討論

酸性成纖維細(xì)胞生長因子（aFGF，F(xiàn)GF-1）是一種多功能生長刺激因子，因aFGF的特殊結(jié)構(gòu)賦予其在血管再生、創(chuàng)傷修復(fù)、骨骼生長、神經(jīng)保護等方面顯示出卓越的臨床應(yīng)用價值，也成為了基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點［2］。但由于aFGF有絲分裂活性可能與細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生有一定的關(guān)系，使aFGF的應(yīng)用受到一定限制。因此，本研究采用改構(gòu)型aFGF觀察其對慢性腦缺血再灌注損傷小鼠的神經(jīng)保護作用。aFGF的N端第21～27位的氨基酸Asn-Tyr-Lys-lys-Pro-Lys-Leu是aFGF促有絲分裂活性的重要氨基酸序列，定向敲除該段序列的第23～26位氨基酸片段，由Met取代Leu，可使其失去促有絲分裂能力，同時保留了非促分裂活性結(jié)構(gòu)域［4］。XU等［3］研究表明MaFGF明顯減輕局灶性缺血再灌注大鼠的腦水腫程度和腦梗死面積，降低丙二醛含量，升高超氧化物歧化酶活性，對急性局灶性缺血再灌注大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果顯示，MaFGF可明顯降低BCAO組小鼠28 d時的mNSS評分，縮短逃避潛伏期，增加穿臺次數(shù)，表明MaFGF能夠改善慢性腦缺血再灌注損傷小鼠的神經(jīng)功能和認(rèn)知記憶力，發(fā)揮長期的神經(jīng)保護作用。

圖5 各組小鼠海馬CA1區(qū)p-AKT、GRP170免疫陽性顆粒表達(dá)情況（×200）

腦缺血再灌注后，神經(jīng)元細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡，因此細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的中心環(huán)節(jié)和治療主要靶點。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）、鈣超載、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等諸多因素，均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有關(guān)鍵作用。當(dāng)ERS過強或持續(xù)存在時，一方面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能無法恢復(fù)，使細(xì)胞失衡轉(zhuǎn)向凋亡，一方面誘導(dǎo)激活增強劑結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶12（Caspase12）等激活細(xì)胞凋亡通路，通過凋亡清除受損嚴(yán)重的細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，BCAO小鼠海馬CA1區(qū)CHOP、Caspase-12表達(dá)明顯升高，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，提示腦缺血再灌注損傷小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白170（GRP170），是駐留在ER中的主要分子伴侶，與GRP78具有相似的調(diào)控作用。有文獻(xiàn)報道GRP170可以作為一種核苷酸交換因子（NEF），觸發(fā)結(jié)合免疫球蛋白（BiP）核苷酸轉(zhuǎn)錄形成ATP-BiP，除了其公認(rèn)的NEF活性外，其還包含一個C端保持酶閾，能夠促進未折疊或錯誤折疊蛋白的降解，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而起保護作用［5-6］。因此GRP170的高表達(dá)可以促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的穩(wěn)定，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，BCAO小鼠海馬區(qū)GRP170表達(dá)無明顯改變，這可能是在發(fā)生ERS初期，GRP170應(yīng)激性增多以激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能；但ERS持續(xù)存在，使得GRP170大量消耗而逐漸減少。aFGF可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護作用，HU等［7］應(yīng)用aFGF鼻內(nèi)給藥1周持續(xù)治療新生兒缺血缺氧型腦損傷，可顯著減少腦梗死面積，通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮長期的神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果顯示MaFGF可上調(diào)BCAO小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞GRP170的表達(dá)，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，降低CHOP、Caspase-12的表達(dá)水平，減少神經(jīng)元凋亡。

FGF可通過與FGF受體結(jié)合，促使FGF受體磷酸化并產(chǎn)生酪氨酸蛋白激酶活性，啟動PI3K途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑、絲裂原活化蛋白酶（MAPK）途徑等發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，其中PI3K/AKT通路是aFGF在神經(jīng)組織中發(fā)揮作用的主要信號途徑［8-9］。外源性aFGF可通過激活PI3K-Akt-Rac1信號通路部分降低小分子G蛋白RhoA活性，從而改善腦外傷后的神經(jīng)功能缺陷和保持血腦屏障完整性［10］。WANG等［11］研究發(fā)現(xiàn)bFGF可作用于靶細(xì)胞誘發(fā)PI3K信號通路級聯(lián)反應(yīng)，激活下游ERK1/2、AKT、GSK3β通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERS），從而減少神經(jīng)組織病變和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究顯示，MaFGF可增加BCAO小鼠神經(jīng)元細(xì)胞PI3K、AKT的磷酸化，表明MaFGF可能是通過激活PI3K/AKT信號通路級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮抗凋亡作用。

綜上，MaFGF能夠明顯改善慢性腦缺血再灌注損傷小鼠的神經(jīng)功能，改善認(rèn)知和記憶能力，其可能機制是通過激活PI3K/AKT信號通路，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。