陳紅 ，李慶亮 ，段凱 ，石晨 ，張東 ，董犇 ，白萱 ，喬建 ，徐葛林 ，楊曉明，高招，李放軍，呂華坤，周海松，鄢廷棟，施海云

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢430207；2.中國生物技術(shù)股份有限公司，北京100029；3.河北省疾病預(yù)防控制中心，河北石家莊050000；4.湖南省疾病預(yù)防控制中心，湖南長沙410005；5.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江杭州310051；6.正定縣疾病預(yù)防控制中心，河北正定050800；7.湘潭縣疾病預(yù)防控制中心，湖南湘潭411200；8.玉環(huán)市疾病預(yù)防控制中心，浙江玉環(huán)317600

輪狀病毒（rotavirus，RV）感染是導(dǎo)致全球 5 歲以下兒童腹瀉相關(guān)死亡病例的主要原因之一，2016年全球由于RV 感染引起的5 歲以下兒童死亡病例數(shù)達(dá)128 500 例，其中撒哈拉以南的非洲、東南亞和南亞的死亡率最高［1］。RV 屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬，1973 年，通過電鏡首次觀察到腹瀉患兒糞便中的RV［2］。成熟的RV 顆粒為對稱的二十面體球形，無包膜，病毒顆粒直徑約75 nm?；蚪M為11 段dsRNA，編碼 6 種結(jié)構(gòu)蛋白和 6 種非結(jié)構(gòu)蛋白［3］，其中基因片段9 編碼的表面蛋白VP7 是RV 主要的中和抗原之一。根據(jù)VP7 基因核苷酸序列的相似性和差異性，RV 分為不同的G 基因型，目前至少定義了 36 種 G 基因型［4］。

RV 易發(fā)生變異，目前，G1-G4、G9 和 G12 是全球主要的優(yōu)勢流行株［5］。監(jiān)測結(jié)果顯示，2011—2014 年中國26 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）5 歲以下兒童RV 感染腹瀉病例中，G9 型占比不斷增加，G3、G1 及 G2 型占比逐年降低［6］。王芳［7］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2004 年前，蘭州市主要流行G 基因型為G3，2004 — 2005 年轉(zhuǎn)變?yōu)?G2，2005 — 2007 年為 G1，2007 — 2012 年間 G3再次成為流行基因型，2013 年后流行基因型為G9。ZENG 等［8］對 2011 — 2015 年重慶市嬰幼兒門診腹瀉病例樣本分析顯示，G 基因型優(yōu)勢流行株從G1 變?yōu)镚9，2013 年以后G9 檢出率逐漸增加。TINA等［9］對 2011 — 2016 年北京市 5 歲以下兒童門診腹瀉病例基因型的分析表明，2012 年前G3 為優(yōu)勢流行株，2012 年后為G9?；虻淖儺惡瓦M(jìn)化導(dǎo)致其抗原發(fā)生漂移和轉(zhuǎn)移，影響病毒的傳播和流行［10］。

目前，RV 感染引起的兒童急性胃腸炎無特異性抗病毒治療藥物，疫苗是控制該疾病的有效手段［11］。國際上廣泛應(yīng)用的口服RV 疫苗主要是Rotarix 和RotaTeq，RotaTeq（WC3 株）為五價(jià)人-牛重配口服減毒活疫苗，包含G1 ～G4 的4 株VP7 基因重配株及1株 P［8］的 VP4 基因重配株；Rotarix 為單價(jià)口服減毒活疫苗，其VP7 基因?yàn)镚1。2007 年，武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司從國外引進(jìn)六價(jià)UK-人重配疫苗株毒種用于RV 疫苗的生產(chǎn)，其VP7 基因?yàn)镚1、G2、G3、G4、G8 和 G9。本研究收集了 2016 — 2017 年間河北正定縣、湖南湘潭縣及浙江玉環(huán)市2 歲以下兒童腹瀉監(jiān)測的糞便樣本，對RV 陽性樣本進(jìn)行測序分型，通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹等分析方法，探討RV VP7 基因的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，比較UK-人重配疫苗毒株與3 個(gè)地區(qū)流行株VP7 基因序列同源性和進(jìn)化關(guān)系，以期為UK-人重配疫苗在國內(nèi)的應(yīng)用提供相應(yīng)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本 收集 2016 年 11 月 — 2017 年 4 月間河北正定縣、湖南湘潭縣及浙江玉環(huán)市2 歲以下兒童腹瀉病例RV 陽性糞便樣本（經(jīng)ELISA 試劑盒檢測），共 228 份。

1.2 主要試劑 病毒RNA 提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit 購自美國Qiagen 公司；無水乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RT-PCR 試劑盒Prime-ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 及DNA marker DL2000 購自日本TaKaRa 公司；瓊脂糖購自上海貝晶生物技術(shù)有限公司；DEPC 水購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 糞便樣本處理 將0.1 mL 糞便樣本置裝有0.5 mL DEPC 水的1.5 mL 離心管中，獲得10% ～20%的糞便懸浮液，旋渦振蕩 1 min，2 823 × g 離心5 min；收集上清，于-30 ℃保存。

1.4 VP7 基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 中登錄的人RV VP7 基因（M21843、Q650124.1、EF672602.1、LC-482504）序列，應(yīng)用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物，VP7 F：5′-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3′，VP7 R：5′-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 062 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取糞便上清液中的病毒RNA，以其為模板進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。PCR 體系為：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL，2 × 1 Step Buffer 25 μL，VP7 F ／VP7 R 各 1 μL，提取的樣本 RNA 8 μL，RNase Free dH2O 13 μL。PCR 反應(yīng)條件為：50 ℃30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。同時(shí)以DEPC 水為陰性對照，試劑盒中的Positive RNA 為陽性對照。

1.5 VP7 基因測序分析 取20 μL PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序引物為VP7F ／ VP7R。測序結(jié)果應(yīng)用Sequencher 軟件拼接處理，再經(jīng)RV 在線基因分型工具RotaC V2.0 對測序結(jié)果進(jìn)行分型［12］，Mega X 或 Megalign 軟件進(jìn)行比對，分析序列相似性。

1.6 VP7 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹及氨基酸序列分析 從GenBank 中下載RV 的VP7 基因國內(nèi)外近期流行株各型別原型株及不同譜系標(biāo)準(zhǔn)株序列作為參考序列，應(yīng)用Mega X 軟件（http：／／www.megasoftware.net ／）［13］對測序結(jié)果與參考序列進(jìn)行ClustalW 多重比對，構(gòu)建Neighbor-Joining 進(jìn)化樹，通過Kimura-2-parameter模型測量系統(tǒng)發(fā)育距離，Bootstrap 對進(jìn)化樹的可靠性進(jìn)行評價(jià)，重復(fù)1 000 次。應(yīng)用Mega X 軟件將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，分析原型株（G1、G2、G3、G9 型原型株分別為 Wa、DS-1、P、WI61）及 UK-人重配疫苗毒株（G1、G2、G3 及 G9 的 GenBank 登錄號(hào)為GQ225777、GQ225778、GQ225827、GQ225782）和 3 個(gè)地區(qū)樣本VP7 基因氨基酸序列差異性。RV VP7 基因可變區(qū)氨基酸序列有VR1（9 ～20 位氨基酸）、VR2（25 ～ 32 位氨基酸）、VR3（37 ～ 53 位氨基酸）、VR4（65 ～ 76 位氨基酸）、VR5（87 ～ 100 位氨基酸）、VR6（119 ～ 132 位氨基酸）、VR7（141 ～ 150 位氨基酸）、VR8（208 ～ 224 位氨基酸）和 VR9（235 ～ 242 位氨基酸）［14］，VP7 中和抗原表位主要位于 A（87 ～ 100 位氨基酸）、B（141 ～ 150 位氨基酸）和 C（208 ～ 224 位氨基酸）3 個(gè)區(qū)域內(nèi)，即 VR5、VR7 和 VR8 的位置［15］。

2 結(jié) 果

2.1 VP7 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 共有199 份樣本擴(kuò)增并成功測序。RV VP7 基因片段PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 062 bp 的目的基因條帶，大小與預(yù)期一致，部分結(jié)果見圖1。

2.2 VP7 基因測序分析 測序結(jié)果共有4 種G 基因型，即 G1、G2、G3、G9 型，所占比例分別為 10 ／ 199（5.1%）、43 ／199（21.6%）、12 ／ 199（6.0%）、134 ／ 199（67.3%）。其中，正定縣優(yōu)勢流行株為G2，占77.4%；湘潭縣和玉環(huán)市優(yōu)勢流行株均為G9，分別占75.8%和75.5%。見表1。

圖1 部分糞便樣本VP7 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of VP7 gene of partial stool samples

2.3 RV VP7 基因序列特征 3 個(gè)地區(qū)的測序結(jié)果中，G1 型 RV 共 10 份，VP7 核苷酸序列相似性為93.2% ～100.0%，氨基酸序列相似性為96.0% ～100.0%；G2 型 RV 共 42 份，VP7 核苷酸序列相似性為85.4% ～100.0%，氨基酸序列相似性為88.1% ～100.0%；G3 型 RV 共 12 份，VP7 核苷酸序列相似性為81.2% ～100.0%，氨基酸序列相似性為91.4% ～100.0%；G9 型 RV 共 133 份，樣本 VP7 核苷酸序列相似性為78.1% ～100.0%，氨基酸序列相似性為72.8% ～100.0%。G1 型RV 樣本間核苷酸序列差異較小，G9 型RV 樣本間的核苷酸序列差異性相對較大，部分結(jié)果見表2 和表3。

表1 3 個(gè)地區(qū)VP7 基因測序分型結(jié)果Tab.1 Sequencing and typing of VP7 gene in three regions

表2 G1 型樣本核苷酸序列相似性（%）Tab.2 Homology of nucleotide sequences of samples of G1 genotype（%）

2.4 各型RV 與UK-人重配株VP7 基因進(jìn)化分析

2.4.1 G1 型 10 株 G1 型 RV 均集中在 G1-Ⅰ亞型，分屬G1-Ⅰ亞型的2 個(gè)不同分支，其中玉環(huán)市的YH76、YH97、YH84、YH77 和 YH52 5 株處于同一進(jìn)化分支，其他 5 株：XT77、XT68、YH21 和 YH37 處于同一進(jìn)化分支。UK-人重配疫苗毒株G1 與G1 型原型株 Wa（1974，USA）處于 G1-Ⅲ進(jìn)化亞支，親緣關(guān)系較近。10 株G1 型分離株均同G1 型RV 原型株Wa 的VP7 基因的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，處于不同的進(jìn)化樹分支，見圖2。G1 型分離株與Wa 株RV 核苷酸序列相似性為90.6% ～91.9%，與G1 型UK-人重配疫苗毒株核苷酸序列相似性為90.4% ～91.7%。

2.4.2 G2 型 43 株 G2 型 RV 分屬于 G2 Ⅲ-2 和Ⅲ-3 兩個(gè)亞支，其中 ZD24、YH34、XT23 和 XT14 均在Ⅲ-2 亞支，但在G2 Ⅲ-2 的不同分支；其他39 株屬于Ⅲ-3 亞支。UK-人重配疫苗毒株G2 與G2 型原型株 DS-1（1976，USA）處于 G2-Ⅰ進(jìn)化亞支，親緣關(guān)系較近。43 株 G2 型 RV 均與原型株 DS-1 的 VP7 基因的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，處于不同的進(jìn)化樹分支，見圖3。G2 型RV 分離株與DS-1 株RV 核苷酸序列相似性為83.5% ～94.0%，與G2 型UK-人重配疫苗毒株核苷酸序列相似性為83.5% ～94.0%。

表3 G1 型樣本氨基酸序列相似性（%）Tab.3 Homology of amino acid sequences of samples of G1 genotype（%）

圖2 G1 型RV 的VP7 基因核苷酸序列進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of nucleotide sequence of VP7 gene of genotype G1

圖3 G2 型RV 的VP7 基因核苷酸序列進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of nucleotide sequence of VP7 gene of genotype G2

2.4.3 G3 型 12 株 G3 型 RV 分屬于 G3-Ⅳ和 G3-Ⅴ兩個(gè)不同亞支，其中玉環(huán)市的 7 株（YH53、YH4、YH83、YH116、YH117、YH31和YH44）屬于G3-Ⅴ亞型，其他 5株屬于G9-Ⅳ亞型。UK-人重配疫苗毒株G3 與G3型原型株 P（1974，USA）處于 G3-Ⅰ進(jìn)化亞支，親緣關(guān)系較近。12 株 G3 型 RV 均與原型株 P（1974，USA）的VP7 基因的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，處于不同的進(jìn)化樹分支，見圖4。G3 型分離株與P 株RV 核苷酸序列相似性為82.6% ～97.2%，與G3 型UK-人重配疫苗毒株核苷酸序列相似性為82.5% ～97.1%。

2.4.4 G9 型 134 株 G9 型 RV 分屬于 G9-Ⅲ和G9-Ⅵ兩個(gè)不同亞支，其中包括正定縣所有7 株樣本在內(nèi)共73 株G9 型RV 屬于G9-Ⅵ亞型，與中國原型株T203 處于同一亞型，其他61 株處于G9-Ⅲ亞型分支中。UK-人重配疫苗毒株與原型株WI61（1983，USA）處于相同的進(jìn)化亞支G9-Ⅰ，UK-人重配株G9與AU32 株親緣關(guān)系較近。134 株G9 型RV 均與WI61 株的VP7 基因的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，處于不同的進(jìn)化亞支。見圖5。134 株G9 型樣本與WI61 株RV 的VP7 基因核苷酸序列相似性為75.8% ～89.8%，與G9型UK-人重配疫苗毒株VP7 基因核苷酸序列相似性為74.8% ～89.2%。

2.5 各型RV 與原型株及UK-人重配疫苗毒株氨基酸序列差異的比較

2.5.1 G1 型 10 份 G1 型 RV 與原型株及 UK-人重配疫苗毒株比較，多個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在差異，可變區(qū)共有15 個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在差異。A 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有S94N、E97D 和E100D；B 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有N147S 和F148L；C抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有T217M 和V218I。除抗原區(qū)外，可變區(qū)VR3、VR4 及VR9 也有部分氨基酸位點(diǎn)存在差異。見表4。

2.5.2 G2 型 43 份G2 型樣本中，與原型株及UK-人重配疫苗毒株比較，可變區(qū)中共有12 個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在差異。A 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有T87A 和 N96D，YH100 樣本在第 94 位氨基酸對應(yīng)的核苷酸測序峰圖出現(xiàn)重疊峰，導(dǎo)致該位點(diǎn)堿基不能確定；C 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有D213N。其他差異出現(xiàn)在 VR1、VR3、VR4、VR6 和 VR9。見表5。

2.5.3 G3 型 12 份 G3 型樣本與原型株及UK-人重配疫苗毒株比較，可變區(qū)共有17 個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在差異。A 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有S87T和M93I；B 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有N145D；C 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有A212T，T213N。其他可變區(qū)的11 個(gè)氨基酸差異出現(xiàn)在VR1、VR3、VR4 和 VR6。見表6。

2.5.4 G9 型 134 份 G9 型 RV 與原型株及 UK-人重配疫苗毒株比較，共有32 處氨基酸位點(diǎn)存在差異。A 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有T87A、A90S 和N100D；B 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有H144Y、A147T 和E149K；C 抗原區(qū)中存在差異的氨基酸位點(diǎn)有 I208T、T220A 和 G221S，見表7 和表8。其中，aa87、aa149 和 aa220 3 個(gè)位點(diǎn)的分離株與疫苗株和原型株WI61 完全不同，而與國內(nèi)原型株T203相同，表明國內(nèi)流行的 G9 型 RV 在 aa87、aa149 和aa220 3 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異。其他可變區(qū)的氨基酸差異出現(xiàn)在 VR1、VR2、VR3、VR4、VR6 和 VR9。

圖4 G3 型RV 的VP7 基因核苷酸序列進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of nucleotide sequence of VP7 gene of genotype G3

圖5 G9 型RV 的VP7 基因核苷酸序列進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of nucleotide sequence of VP7 gene of genotype G9

表4 G1 型RV 的VP7 基因與原型株及UK-人重配疫苗毒株氨基酸差異比較Tab.4 Difference in amino acid sequences of VP7 gene of RV of G1 genotype from prototype and UK-human reassortant vaccine virus strain

表5 G2 型RV 的VP7 基因與原型株及UK-人重配疫苗毒株氨基酸序列差異Tab.5 Difference in amino acid sequences of VP7 gene of RV of G2 genotype from prototype and UK-human reassortant vaccine virus strain

表6 G3 型RV 的VP7 基因與原型株及UK-人重配疫苗毒株氨基酸差異比較Tab.6 Difference in amino acid sequences of VP7 gene of RV of G3 genotype from prototype and UK-human reassortant vaccine virus strain

表7 正定和湘潭縣G9 型RV 的VP7 基因與原型株及UK-人重配疫苗毒株氨基酸序列差異比較Tab.7 Difference in amino acid sequences of VP7 gene of RV of G9 genotype in Zhengding and Xiangtan Counties from prototype and UK-human reassortant vaccine virus strain

續(xù)表7 正定和湘潭縣G9 型RV 的VP7 基因與原型株及UK-人重配疫苗毒株氨基酸序列差異比較Tab.7（Continued）Difference in amino acid sequences of VP7 gene of RV of G9 genotype in Zhengding and Xiangtan Counties from prototype and UK-human reassortant vaccine virus strain

表8 玉環(huán)市G9 型RV 的VP7 基因與原型株及UK-人重配疫苗毒株氨基酸序列差異比較Tab.8 Difference in amino acid sequences of VP7 gene of RV of G9 genotype in Yuhuan City from prototype and UK-human reassortant vaccine virus strain

續(xù)表8 玉環(huán)市G9 型RV 的VP7 基因與原型株及UK-人重配疫苗毒株氨基酸序列差異比較Tab.8（Continued）Difference in amino acid sequences of VP7 gene of RV of G9 genotype in Yuhuan City from prototype and UK-human reas-sortant vaccine virus strain

3 討 論

3.1 進(jìn)化樹分析 本研究對2016 年11 月— 2017年4 月間來自河北正定、湖南湘潭和浙江玉環(huán)3 個(gè)地區(qū)的RV 陽性糞便標(biāo)本進(jìn)行了VP7 基因測序及分型，確定了199 份樣本的核酸序列及VP7 基因型，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，199 份樣本均與各自基因型原型株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與原型株核苷酸序列相似性在 75%以上。在 10 株 G1 型 RV 中，YH76、YH97、YH84、YH77 和 YH52 與 2012 年 的 日 本 分 離 株OH3592 親緣關(guān)系較近，處于同一進(jìn)化分支，XT77、XT68、YH21 和 YH37 與 2017 年中國分離株 E5365親緣關(guān)系較近，YH120 與2007 年遼寧分離株F1199處于同一進(jìn)化亞支；在 43 株 G2 型 RV 中，ZD24 與2005 年孟加拉國分離株MMC88 親緣關(guān)系較近，YH34、XT23 和 XT14 與 2011 年日本B110056 株親緣關(guān)系較近，這4 株均在G2Ⅲ-2 亞支，其他39 株屬于 G2 Ⅲ-3 亞支，與 2015 年昆明株 km15028、2014 年北京株F440、2017 年日本株Tokyo17-15 及泰國2017年B3517 株和2018 年DBM2018-105 株親緣關(guān)系較近；在 12 株 G3 型 RV 中，YH53、YH4、YH83、YH116、YH117、YH31 和 YH44 與 2016 年臺(tái)灣株 08-102-689219-25-6 和 2018 年日本株 Tokyo18-25 親緣關(guān)系較近，XT8 與2010 年中國分離株E2432 親緣關(guān)系較近，YH69、XT26 和 YH87 與 2017 年日本分離株Tokyo17-08 株親緣關(guān)系較近，YH35 與土耳其1RIZE-2016 株親緣關(guān)系較近；在 134 株 G9 型 RV 中，處于G9-Ⅵ亞型的73 株與2012 年日本分離株S120088、中國分離株JS2013 及BJ-Q794 等親緣關(guān)系較近，其他 61 株與中國分離株 km15099、km15118 及1RV-652564 等親緣關(guān)系較近。玉環(huán)市的G3 型RV 分屬于兩個(gè)亞型，玉環(huán)市和湘潭縣的G9 同樣也分屬兩個(gè)不同的G9 亞型，G3 和G9 型RV 樣本核苷酸與氨基酸差異性相對較大，表明在這兩個(gè)地區(qū)流行株中G3和G9 流行的亞型具有多樣性。

3.2 G9 型RV 流行特征 G9 型毒株最早于1983年在美國發(fā)現(xiàn)。在許多國家，G9 型被認(rèn)為是最常見的新血清型之一，我國于1994 年首次檢測到G9型毒株（T203）［16］，隨后幾年內(nèi)僅在少數(shù)地區(qū)檢出，至2004 年逐漸增多，檢出率也呈波動(dòng)性上升趨勢［17］。本研究表明，湘潭縣和玉環(huán)市優(yōu)勢流行株均為G9，占比67.3%，為主要優(yōu)勢流行株。根據(jù)VP7 基因片段的核苷酸序列分析，G9 型RV 毒株分為Ⅰ ～Ⅵ 6 個(gè)分支［18］，134 份 G9 樣本主要分布在 G9-Ⅲ和 G9-Ⅵ兩個(gè)亞型，其中屬于G9-Ⅵ亞型的73 株（54.5%）RV與中國原型株T203 核苷酸序列相似性為84.2% ～95.5%，61 份（45.5%）G9-Ⅲ型樣本與昆明株km15099、km15118 遺傳距離較近。有研究認(rèn)為，G9-Ⅵ在90年代中后期至2000 年前僅在中國和日本流行，隨后國內(nèi)流行的G9 型RV 主要是G9-Ⅲ，本研究表明，G9-Ⅵ占比超過G9-Ⅲ，呈現(xiàn)優(yōu)勢流行，與董慧瑾等［19］對2011 — 2012 年北京部分腹瀉患兒檢測優(yōu)勢流行株一致。結(jié)果表明，RV 的VP7 基因流行株亞型也在不斷變化。

3.3 氨基酸序列差異分析 本研究結(jié)果表明，G1型RV 氨基酸序列差異較小，可變區(qū)僅有15 個(gè)氨基酸位點(diǎn)不同；G9 型RV 氨基酸序列差異較大，可變區(qū)有32 個(gè)氨基酸位點(diǎn)不同，其原因可能是由于檢測出的G9 型RV 病毒較多，且第一代測序的方法會(huì)有部分樣本測序結(jié)果不佳造成的。通過分析3 個(gè)抗原區(qū)氨基酸序列的變異情況發(fā)現(xiàn)，G2 型RV 抗原區(qū)氨基酸序列差異較小，G2 型UK-人重配株疫苗的保護(hù)效果較好；與原型株 WI61［20］比較，G9 型 RV 抗原區(qū)aa87、149 和220 3 個(gè)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生了變異。

3.4 RV 優(yōu)勢流行株不同地區(qū)存在差異 疫苗是保護(hù)兒童預(yù)防RV 感染的重要手段，自RV 疫苗問世以來，在保護(hù)兒童預(yù)防重癥腹瀉上發(fā)揮了重要作用。VP7 蛋白作為RV 關(guān)鍵的中和抗原之一，可誘發(fā)保護(hù)性中和抗體，目前上市的疫苗多以VP7 蛋白為主要抗原設(shè)計(jì)而來。本研究表明，正定縣的優(yōu)勢流行株為G2，同時(shí)期的湘潭縣和玉環(huán)市優(yōu)勢流行株則為G9，一種有效的疫苗必須包括與流行地區(qū)抗原性相同的病毒株。

綜上所述，不同地區(qū)在同一時(shí)間優(yōu)勢流行株不同，且流行株的亞型也在發(fā)生變化，各G 血清型的RV 樣本間的核苷酸序列差異性也有不同。研究可變區(qū)發(fā)生變異的氨基酸位點(diǎn)對發(fā)現(xiàn)野毒株逃逸機(jī)制具有一定意義。因此，對不同地區(qū)的RV 進(jìn)行持續(xù)的監(jiān)測十分必要。