楊懷璽,陳 林，蘇妍卓，王雪峰，丁大勇

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胃腸結(jié)直腸外科,吉林 長春130033)

隨著腸道免疫功能研究的深入,腸道黏膜分泌的一系列具有抗菌作用的短肽受到了高度重視。這些短肽在胃腸道中對一定種類的有害病原體具有抑制或殺滅作用,對腸道正常菌群干擾較小,參與人體腸道黏膜屏障的功能。在既往研究中，本課題組利用生物工程技術(shù)重組表達(dá)、純化了小鼠抗菌肽Reg3γ，掌握了該蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的合適條件。HIP/PAP是其同源的由人腸道潘氏細(xì)胞分泌的抗菌肽，本文利于該技術(shù)進(jìn)一步表達(dá)和純化了HIP/PAP，并對其抗菌作用進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

載體質(zhì)粒pET-30b(+)購自Novagen公司；限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶購自TaKaRa公司；真核表達(dá)菌株E.coli B21購自Agilent公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α，購自TaKaRa公司；糞腸球菌(E.faecalis)和大腸桿菌(E.coli)由本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種；透析袋購自Spectrum Laboratories公司；陽離子交換柱及凝膠柱購自GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建 HIP/PAPmRNA引物設(shè)計(jì)序列：上游引物：5’- ATTGCGAGGCATATGGAAGAACCACAAAGAGAACTGC-3’；下游引物：5’-CTATGGTGATCACTAGTCAGTGAACTTGCAGACATAGGGTAA-3’，引物上下游分別包含NdeI酶切位點(diǎn)和BclI酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為：94℃2 min;94℃20 s、60℃30 s、72℃30 s行30個(gè)循環(huán)，72℃5 min。

將HIP/PAP PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體為pET-30b(+)質(zhì)粒行NdeI和BclI雙酶切。酶切后的目的片段和載體通過DNA連接酶將連接成pET-30b(+)-HIP/PAP。常規(guī)擴(kuò)增抽提重組質(zhì)粒pET-30b(+)-HIP/PAP。對擴(kuò)增的質(zhì)粒行雙酶切鑒定及測序。將重組的pET-30b(+)-HIP/PAP轉(zhuǎn)化真核表達(dá)載體E.coli B21-CodonPlus(DE3)在含有卡那霉素(30 μg/mL)和氯霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，低溫保存真核表達(dá)載體。

1.2.2重組蛋白的表達(dá)及純化 根據(jù)既往研究Reg3γ的實(shí)驗(yàn)條件表達(dá)重組蛋白。將真核表達(dá)載體E.coli B21-CodonPlus(DE3)挑菌到20 mL含卡那霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，小規(guī)模制備。明確實(shí)驗(yàn)條件后，將培養(yǎng)過夜的工程菌液加入500 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃搖床培養(yǎng)4 h，使用0.5 mM/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h。低溫6 500 g離心15 min，留取沉淀。以超聲細(xì)胞破碎器將細(xì)菌破碎后使用清洗緩沖液重懸沉淀。將重懸液低溫10 000 g離心10 min，留取沉淀。再次重懸清洗沉淀部分。將重懸液緩慢滴入復(fù)性緩沖液中，4℃緩慢攪拌24 h。

室溫下10 000 g離心復(fù)性液30 min，棄沉淀，將上清液裝入透析袋。透析緩沖液置于4℃透析24 h。同樣條件透析兩次。使用陽離子交換柱及凝膠柱進(jìn)一步純化重組HIP/PAP蛋白。

1.2.3SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色 將重組HIP/PAP蛋白樣品20 μL沸水中煮5 min，輕度離心后上樣。以5%濃縮膠和15%分離膠行SDS-PAGE電泳。電泳后的凝膠置入考馬斯亮藍(lán)染色液中震蕩染色30 min。加入脫色液，振蕩過夜。

1.2.4重組蛋白的體外酶切及體外抗菌實(shí)驗(yàn) 用胰蛋白酶消化4 μg表達(dá)純化的HIP/PAP重組蛋白 (胰蛋白酶：重組蛋白比例為1∶200，37℃水浴，反應(yīng)1 h)。酶切產(chǎn)物及對照行SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色。

使用平板計(jì)數(shù)法(CFU)檢測重組HIP/PAP抗菌活性。對數(shù)生長期細(xì)菌低溫 5 000 g離心留取沉淀。沉淀細(xì)菌重懸后，進(jìn)行梯度稀釋。計(jì)算各濃度的菌落數(shù)。梯度濃度的重組蛋白和細(xì)菌數(shù)100 到 300 CFU/mL之間濃度的菌液混合培養(yǎng)2 h，涂BHI平板培養(yǎng)過夜。CFU計(jì)數(shù)，以HIP/PAP蛋白/對照組CFU為統(tǒng)計(jì)變量，重復(fù)5次，制散點(diǎn)圖。

1.2.5統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)均用SPSS23.0軟件分析。采用t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的目的基因HIP/PAP經(jīng)雙重酶切后純化，行電泳顯示擴(kuò)增出的條帶大小與理論值(474 bp)相符(圖1)。擴(kuò)增的HIP/PAP DNA與質(zhì)粒通過DNA連接酶連接成為重組質(zhì)粒pET-30b(+)-HIP/PAP，其雙酶切鑒定結(jié)果如圖2。重組蛋白HIP/PAP在工程菌E.coli B21-CodonPlus(DE3)大量表達(dá)，其包涵體在復(fù)性液的作用后產(chǎn)物經(jīng)透析濾除中小分子雜質(zhì)。以SP Sepharose Fast Flow 陽離子交換柱純化后仍含有大分子雜質(zhì)，行SephacrylTMS-200 HR凝膠柱進(jìn)一步純化重組HIP/PAP蛋白(圖3，圖4)。純化的重組HIP/PAP蛋白行胰蛋白酶切。重組HIP/PAP蛋白質(zhì)被Trypsin水解為略小的約15 kD的蛋白質(zhì)(圖5)。

圖1 HIP/PAP基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳MW為DNA marker。

圖2 pET-30b(+)-HIP/PAP酶切結(jié)果MW為DNA marker。

1.未加IPTG誘導(dǎo)菌液;2.IPTG誘導(dǎo)后菌液;3.超聲碎裂后離心上清;4.包涵體研磨清洗后離心上清;5.復(fù)性蛋白質(zhì)經(jīng)離子交換層析柱純化后。M為蛋白質(zhì)marker。

M為蛋白質(zhì)marker

不同濃度HIP/PAP及酶切的HIP/PAP蛋白對糞腸球菌的CFU進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)HIP/PAP蛋白對糞腸球菌具有明顯的體外抑制作用，該作用隨著HIP/PAP濃度的升高而強(qiáng)化，而且HIP/PAP在被酶切后抗菌作用增強(qiáng)(圖6)。同樣方法研究HIP/PAP對大腸桿菌的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)HIP/PAP及酶切產(chǎn)物對大腸桿菌無體外抗菌作用(圖7)。

1.HIP/PAP;2.HIP/PAP+trypsin

圖6 重組蛋白HIP/PAP和酶切的重組蛋白HIP/PAP+trypsin對糞腸球菌的抗菌作用

3 討論

研究表明HIP/PAP是小腸paneth細(xì)胞分泌的C-型凝集素抗菌肽，具有調(diào)節(jié)腸道內(nèi)細(xì)菌和宿主之間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[1]。本課題組曾利用生物工程技術(shù)重組表達(dá)并純化了小鼠Reg3γ[2]。在此基礎(chǔ)上，本研究重組表達(dá)并純化了抗菌肽HIP/PAP，并且通過CFU法證明了重組HIP/PAP對糞腸球菌有體外抗菌活性。而且，本研究發(fā)現(xiàn)HIP/PAP被胰蛋白酶酶切后體外抗菌活性明顯增強(qiáng)。HIP/PAP對糞腸球菌的體外抗菌活性與細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)。然而，研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)HIP/PAP對大腸桿菌無體外抗菌活性。大腸桿菌和糞腸球菌為腸道內(nèi)常見的革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌。革蘭氏陰性細(xì)菌的肽聚糖位于細(xì)胞壁內(nèi)層，其外側(cè)有脂多糖成分。HIP/PAP對革蘭氏陰性的大腸桿菌無抗菌作用，分析HIP/PAP殺菌功能可能是通過與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。HIP/PAP蛋白N端有1個(gè)11肽的段，可以被胰蛋白酶水解切除[3]。為了解HIP/PAP及酶切蛋白的體外抗菌活性，本研究進(jìn)行了抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組HIP/PAP被胰蛋白酶酶切后體外的抗菌活性明顯增強(qiáng)。

(a)對糞腸球菌CFU的影響 (b)對大腸桿菌CFU的影響