李秀文，趙桂香

(新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830000)

腎細胞癌(RCC) 簡稱腎癌，是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居泌尿系統(tǒng)腫瘤中第三位[1-2]。腎癌在臨床上缺乏典型的癥狀和早期篩查的指標，大約有16%的腎癌患者在確診時已經發(fā)生了轉移[3]。FOXN2(Forkhead Box N2)是FOX家族轉錄因子中的成員之一，與FOXN3是類似物。研究顯示[4-5]，F(xiàn)OXN3在惡性腫瘤中表達下調，表明FOXN3可能是重要的腫瘤抑制基因。本研究通過FOXN2對腎癌細胞增殖、凋亡的影響，期望能為腎癌的靶向治療提供新的思路，尋找腎癌治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人腎癌細胞(786-O)及正常腎小管上皮細胞(HK2)均購買于中國科學院細胞庫。

1.2 主要實驗材料

胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Roswell公司。pcDNA3.1、pcDNA3.1-FOXN2載體(豐暉生物)。FOXN2基因(北京義翹神州)。Lipofectamine2000轉染試劑(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。PI3K Antibody、AKT Antibody、p-AKT Antibody、Bcl-2 Antibody、Bax Antibody、CDK1 Antibody、CyclinD1 Antibody試劑盒均購于Cell Signaling公司，CCK8、Western一抗及二抗稀釋液、去除液、顯影定影試劑盒都購買于艾博抗(上海)貿易有限公司。RT-PCR 儀購自美國BD 公司。HBS-1096B 酶標儀購自瑞士Tecan公司。Western blot電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗細胞處理及分組

實驗設置FOXN2過表達組、空載體對照組、對照組三組。通過Lipofectamine2000將pcDNA3.1-FOXN2、pcDNA3.1轉染腎癌細胞786-O，對照組細胞不做處理。

1.4 通過PCR和Western blot檢測FOXN2在人正常腎上皮細胞HK-2和腎癌細胞786-O中的表達

786-O細胞及HK-2 細胞均種植于RPMI1640 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后消化傳代。采用qRT-PCR法檢測各細胞中的FOXN2，以U6小核RNA作為內參，以2-ΔΔCt表示FOXN2相對表達量。

1.5 通過CCK8及克隆形成實驗檢測FOXN2過表達組、空載體對照組、對照組細胞增殖情況

將FOXN2過表達組、空載體對照組、對照組細胞消化成單細胞懸液后，以2×103個/孔將種植于96 孔板上，每孔培養(yǎng)基體積200 μL，分別于培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在450 nm波長下用酶標儀測定各孔光密度值(OD值) ，以此表示細胞增殖能力。以時間為橫坐標、OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.6 通過流式細胞儀檢測FOXN2過表達組、空載體對照組、對照組細胞凋亡情況

離心收集懸浮細胞(≥1×105)，4℃預冷 PBS 緩沖液0.5 h，洗滌沉淀 2-3 次。1-2 mL PBS緩沖液重懸細胞沉淀成單細胞懸液并細胞計數(shù)板計數(shù)。將細胞懸液分裝至棕色EP 管中(≥1×105)，隨后加入 500 μL 1× Annexin V 結合液。加入 5 μL Annexin V-FITC/EP 管，輕輕混勻后置于4℃避光條件下孵育15 min。加入5 μL PI染色液/流式管后輕輕混勻后置于 4℃避光條件下孵育5 min。將上述經過處理的細胞在流式細胞儀上檢測。設置激發(fā)波長為 488 nm，Annexin V-FITC 綠色熒光通過 FL1 通道檢測；PI 紅色熒光在 620 nm，通過 FL2通道檢測。

1.7 通過Western blot 檢測FOXN2過表達組、空載體對照組、對照組細胞中PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax、CDK1、CyclinD1蛋白表達水平

根據分組設置3個復孔。處理24 h后的細胞用于提取蛋白，Western blot檢測。將FOXN2過表達組、空載體對照組、對照組三組細胞裂解、變性，取 20-30 μL蛋白提取液用于蛋白 BCA 定量。將稀釋好的 BSA 標準品、待測蛋白樣品以25 μL/孔分別加入 96 孔板微孔中，每個樣本設置 3 個復孔。每孔加入 200 μL BCA 工作液，37℃恒溫水平搖床中孵育 30 min，將酶標儀波長設置為 562 nm，測定每個孔的吸光度值(OD 值)。根據 A-G 標準品的 OD 值繪制標準曲線，根據標準曲線計算蛋白樣品的濃度。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 HK-2細胞和786-O細胞中FOXN2表達變化

與HK-2細胞相比，786-O細胞中的FOXN2蛋白表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與對照組相比，空載體組786-O細胞中FOXN2蛋白表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；FOXN2過表達組786-O細胞中FOXN2蛋白表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2 各組細胞增殖能力比較

與對照組相比，在0、24、48、72和96 h空載體組786-O細胞增殖OD值無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在48、72和96 h FOXN2過表達組786-O細胞增殖OD值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組細胞凋亡情況比較

與對照組相比，空載體組786-O細胞凋亡率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；FOXN2過表達組786-O細胞增殖OD值明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 HK-2細胞、786-O細胞及空載體和過表達786-O細胞的FOXN2蛋白表達

圖2 786-O細胞及空載體和過表達786-O細胞的增殖

圖3 786-O細胞及空載體和過表達786-O細胞的凋亡率

2.4 各組細胞中蛋白表達水平

與對照組相比，空載體組786-O細胞PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax、CDK1和CyclinD1蛋白表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；FOXN2過表達組786-O細胞p-AKT、Bcl-2、CDK1和CyclinD1蛋白表達明顯降低，Bax蛋白表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 786-O細胞及空載體和過表達786-O細胞的蛋白表達

3 討論

腎癌作為高侵襲性的疾病，在目前已知的腫瘤中，發(fā)病率排名第13位[6]。早中期腎癌治療的主要手段仍然是手術，晚期腎癌對放療、化療大部分表現(xiàn)為不敏感，靶向治療對于晚期腎癌的患者，五年生存率不能得到明顯的提高[7]。

FOX家族是轉錄因子家族，近年來，作為與癌癥相關蛋白的角色在許多研究報道中頻頻出現(xiàn)。有研究者通過基因檢測方法發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXN3基因的上調和沉默可以影響N 鈣黏蛋白、Snail和c-Myc的相關表達量。β-連環(huán)蛋白/TCF信號通路通過FOXN3表達量的下降而激活，結腸癌腫瘤細胞從而加速發(fā)展[8]。此外，在縱隔原發(fā)人B 細胞淋巴瘤，F(xiàn)OXO1起到了腫瘤抑制的作用[9]。在乳腺癌HER-2 過表達組，PI3K/AKT 的活性受FOXO1A阻滯，從而減慢了癌細胞的生長速度[10]。綜上所述，這些FOX亞家族蛋白發(fā)揮著抑癌作用。有研究人員發(fā)現(xiàn)：在胃癌及宮頸癌細胞中，F(xiàn)OXM1 和血管內皮生長因子VEGF的表達呈正相關，VEGF 的表達通過FOXM1影響而上調，大量的新生血管生成，進而促進腫瘤的生長和遷移[11]。因此，F(xiàn)OXM1是一個癌蛋白，促進癌的發(fā)展。

本文就FOX 家族中的一個亞家族--FOXN2蛋白進行研究，通過它過表達對腎癌細胞增殖、凋亡的影響做了深入的探索。首先，初步確定了 FOXN2 基因在人正常腎小管上皮細胞和人腎癌細胞里的表達差異，本研究結果顯示：人腎癌細胞(786-O)及正常腎小管上皮細胞(HK2)中的 FOXN2 基因在mRNA水平上的表達有極顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。786-O 中的 FOXN2 基因在 mRNA 水平的表達比HK2中的極顯著降低。為了探究 FOXN2 對腎癌細胞生長增殖，凋亡情況等多種生物學功能的影響，本實驗用脂質體細胞轉染法將FOXN2 基因導入 786-O中，使得FOXN2 在細胞中高表達，并首先檢測這種方法的轉染效率。結果顯示，在實驗組細胞轉染48 h 后，F(xiàn)OXN2過表達組的細胞 FOXN2 的表達量與空載體對照組和對照組細胞的表達量有極顯著的統(tǒng)計學差異(P均<0.01)。轉染了 FOXN2 實驗組的細胞中，F(xiàn)OXN2在mRNA水平上的表達量比空載體對照組的表達量極顯著提高了。在實驗組細胞轉染72 h后，F(xiàn)OXN2過表達組的細胞FOXN2蛋白的表達量與空載體對照組和對照組細胞的表達量有極顯著的統(tǒng)計學差異(P均<0.01)。轉染了 FOXN2實驗組的細胞中，F(xiàn)OXN2 在蛋白水平上的表達量比對照組和空載體對照組中細胞FOXN2的蛋白表達量極顯著提高了。CCK-8檢測的第一天和第二天，三組細胞的生長增殖情況沒有差異。48 h后開始，轉染了 FOXN2基因的細胞生長增殖能力和不處理的對照組細胞有了顯著差異(P<0.05)。FOXN2過表達組細胞的生長增殖速度明顯低于其他兩組的細胞。由此說明 FOXN2過表達對腎癌細胞的生長增殖起到了抑制作用，在一定程度上，減緩了腎癌細胞的惡性增殖。FOXN2過表達組細胞凋亡率與對照組相比也明顯增加。

綜上所述，通過對細胞生物學功能方面的檢測得出 FOXN2 過表達影響著細胞的生長增殖、凋亡，F(xiàn)OXN2 是一個抑癌基因，發(fā)揮著抑癌作用，它可能成為一種新的腎癌治療靶點。研究結果顯示，F(xiàn)OXN2過表達組p-AKT、凋亡抑制因子Bcl-2、CDK1、CyclinD1蛋白表達降低(P<0.05)，Bax的表達明顯增高，由此可見，F(xiàn)OXN2可能與 PI3K-AKT 通路存在關聯(lián)。