張劍春, 陶 濤,劉俊啟

1)駐馬店市中心醫(yī)院新生兒科 河南駐馬店 463000 2)河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450003 3)河南省人民醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450003

腎母細胞瘤又稱腎胚腫瘤，是兒童最常見的惡性腫瘤，約占兒童所有實體瘤的8%[1]。盡管目前的研究[2]發(fā)現(xiàn)了一些關(guān)于腎母細胞瘤的相關(guān)基因，例如p53、WT1、WTX和CTNNB1，但腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制仍不清楚。微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性RNA，長度為18～25個核苷酸[3]。研究[4]表明，miR-190b在多種腫瘤組織中異常表達。PTEN/PI3K/AKT信號通路是各種腫瘤生物學(xué)過程中的關(guān)鍵信號通路，靶向PTEN通路的分子已廣泛用于腫瘤的治療[5]。PTEN/PI3K/AKT軸構(gòu)成了一條重要的途徑，可控制多種生物信號傳導(dǎo)過程，例如代謝、凋亡、細胞生長和細胞增殖[6]。然而，PTEN/PI3K/AKT信號通路對腎母細胞瘤發(fā)病機制和進展的影響仍然未知。本研究旨在探討miR-190b對人腎母細胞瘤細胞SK-NEP-1增殖、遷移和凋亡的影響，為進一步闡明miR-190b在腎母細胞瘤中發(fā)揮的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料組織標本：收集駐馬店市中心醫(yī)院2019年7～9月收治的20例腎母細胞瘤患者[男，8例，38～75(56.3±3.5)歲；女，12例，46～70(58.1±4.1)歲]的腫瘤組織、癌旁正常組織，保存在-80 ℃直至使用，患者均未在手術(shù)前進行化療，并經(jīng)術(shù)后病理確診?；颊呔炇鹬橥鈺袑嶒灳@得本院倫理委員會的批準與監(jiān)督。細胞：人腎母細胞瘤細胞系SK-NEP-1購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol試劑、PrimeScriptTMRT Reagen試劑盒和SYBR?Premix EX TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-對照(NC)、miR-190b模擬物、miR-190b抑制劑由Genepharma公司合成；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；pmirGLO載體、雙熒光素酶活性檢測試劑盒和8 μm孔徑的Transwell小室購自美國Promega公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒購自美國Abcam公司；PTEN、PI3K、p-AKT、AKT、β-actin抗體和山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染SK-NEP-1細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期SK-NEP-1細胞分為4組。空白對照組：不進行任何處理；miR-NC組：轉(zhuǎn)染miR-NC質(zhì)粒；miR-190b模擬物組：轉(zhuǎn)染miR-190b模擬物質(zhì)粒；miR-190b抑制劑組：轉(zhuǎn)染miR-190b 抑制劑質(zhì)粒。按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書將100 nmol/L的miR-NC、miR-190b模擬物、miR-190b抑制劑分別轉(zhuǎn)入SK-NEP-1細胞中，在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.3qRT-PCR測定組織標本或SK-NEP-1細胞中miR-190b的表達用Trizol試劑提取組織標本或細胞總RNA，檢測總RNA的純度和含量，使用PrimeScriptTMRT Reagen試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-190b正向引物序列為5’-GGGT GATATGTTTGATAT-3’，反向引物序列為5’-CAGT GCGTGTCGTGGAGT-3’，產(chǎn)物大小214 bp；內(nèi)參U6正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，產(chǎn)物大小227 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性15 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸75 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-190b的相對表達量。細胞實驗重復(fù)3次。

1.4免疫組化SP法測定組織中PTEN、PI3K、p-AKT蛋白的表達切取小塊組織，固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并制成5 μm厚的石蠟切片。切片在抗原修復(fù)液(96～98 ℃)中放置15 min。將切片放入新鮮配制的體積分數(shù)3% H2O2溶液中8 min，使內(nèi)源性過氧化物酶滅活。接著滴加體積分數(shù)10%山羊血清封閉液，室溫孵育20 min后，用濾紙吸取多余液體。滴加PTEN、PI3K、p-AKT一抗(稀釋度1∶500)，4 ℃孵育過夜。之后滴加相應(yīng)的二抗(稀釋度1∶1 000)，室溫孵育2 h。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。目標蛋白呈棕黃色，則為陽性表達。高倍鏡下計數(shù)500個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞百分比。

1.5miR-190b與PTEN靶向關(guān)系的預(yù)測和鑒定通過TargetScan數(shù)據(jù)庫分析miR-190b的靶基因。將PTEN 3’UTR野生型(WT)/突變型(MUT)克隆到pmirGLO載體中，然后將miR-NC或miR-190b模擬物與pmirGLO-PTEN-WT或pmirGLO-PTEN-MUT共轉(zhuǎn)染至SK-NEP-1細胞中，48 h后應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定細胞的熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.6細胞集落形成實驗測定SK-NEP-1細胞的增殖能力各組細胞經(jīng)處理48 h后，收集并接種到60 mm的培養(yǎng)皿中，2 d更換一次培養(yǎng)基。14 d后，用結(jié)晶紫染色，計數(shù)含有≥50個細胞的集落，并進行拍照。實驗重復(fù)3次。

1.7SK-NEP-1細胞侵襲、遷移能力的測定細胞侵襲能力測定：采用Transwell侵襲實驗。收集處理48 h后的各組細胞，消化后制成細胞懸液，調(diào)細胞密度為1×105個/mL。將Transwell小室之間用基質(zhì)膠分隔，上室接種200 μL細胞懸液，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。然后將Transwell小室置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育12 h。取出基質(zhì)膠，用棉簽擦去膠和頂室上的細胞，然后用40 g/L多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色。200倍視野下選擇5個區(qū)域計數(shù)入侵細胞的數(shù)量并取平均值。實驗重復(fù)3次。

細胞遷移能力測定：采用Transwell遷移實驗。方法同上，但不用基質(zhì)膠。實驗重復(fù)3次。

1.8SK-NEP-1細胞凋亡率的測定收集處理48 h后的各組細胞，離心并重懸于緩沖液中。將細胞依次用Annexin V溶液10 μL和PI溶液10 μL染色，室溫下黑暗中孵育30 min，然后使用流式細胞儀測定凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.9Western blot法檢測SK-NEP-1細胞中PTEN、PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表達處理48 h后的各組細胞用RIPA裂解，提取總蛋白，按照BCA法進行定量。蛋白樣品經(jīng)變性后上樣，按照實驗步驟進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉(50 g/L脫脂奶粉液)、一抗孵育[PTEN、AKT、p-AKT、兔抗β-actin(稀釋度1∶2 000)或PI3K抗體(稀釋度1∶1 000)，4 ℃過夜]、二抗孵育[山羊抗兔IgG(稀釋度1∶1 000)，室溫1 h]、顯影曝光。采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行灰度值測定，目的蛋白相對表達量為目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值。實驗重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。

腎母細胞瘤及癌旁正常組織中miR-190b相對表達量及PTEN、PI3K、p-AKT蛋白陽性細胞百分比的比較采用配對資料的t檢驗；兩組雙熒光素酶活性的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；不同組間SK-NEP-1細胞miR-190b相對表達量、集落形成數(shù)、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、凋亡率，PTEN、PI3K蛋白相對表達量及p-AKT/AKT的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組組織中miR-190b表達的比較結(jié)果(表1)顯示，腎母細胞瘤組織中miR-190b的相對表達量高于癌旁正常組織。

2.2兩組組織中PTEN、PI3K、p-AKT蛋白表達的測定結(jié)果(圖1和表1)顯示，PTEN和PI3K主要在細胞質(zhì)中表達，而p-AKT主要在細胞核中表達。腎母細胞瘤組織中PTEN的陽性細胞百分比低于癌旁正常組織，PI3K和p-AKT的陽性細胞百分比高于癌旁正常組織。

2.3miR-190b與PTEN靶向關(guān)系的預(yù)測和鑒定TargetScan預(yù)測miR-190b和PTEN之間的結(jié)合位點見圖2。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果(表2)顯示，PTEN 3’UTR WT和miR-190b模擬物共轉(zhuǎn)染的SK-NEP-1細胞中的熒光素酶活性降低。

2.4各組SK-NEP-1細胞中miR-190b相對表達量的比較結(jié)果(表3)顯示，miR-190b模擬物組中miR-190b相對表達量高于空白對照組和miR-NC組，miR-190b抑制劑組中miR-190b相對表達量低于空白對照組和miR-NC組。

表1 兩組組織中miR-190b相對表達量及PTEN、PI3K、p-AKT蛋白陽性細胞百分比的比較(n=20)

圖1 癌旁正常(上排)及腎母細胞瘤(下排)組織中PTEN、PI3K、p-AKT蛋白表達的檢測(SP，×200)

圖2 miR-190b與PTEN之間的結(jié)合位點

表2 雙熒光素酶報告實驗熒光素酶活性測定結(jié)果(n=3)

表3 各組SK-NEP-1細胞中miR-190b相對表達量的比較(n=3)

2.5各組SK-NEP-1細胞增殖、侵襲與遷移能力及凋亡率的比較細胞集落形成實驗結(jié)果(圖3和表4)顯示，與空白對照組和miR-NC組相比，miR-190b模擬物組SK-NEP-1細胞增殖能力提高，miR-190b抑制劑組增殖能力下降。細胞侵襲、遷移實驗及凋亡率檢測結(jié)果(表4)顯示，與空白對照組和miR-NC組相比，miR-190b模擬物組的遷移和侵襲能力提高，凋亡率下降;miR-190b抑制劑組的遷移和侵襲能力下降，凋亡率上升。

2.6各組SK-NEP-1細胞中PTEN、PI3K蛋白相對表達量及p-AKT/AKT的比較Western blot結(jié)果(圖4和表5)表明，與空白對照組和miR-NC組相比，miR-190b模擬物組中PTEN蛋白表達下調(diào)，而PI3K和p-AKT/AKT上調(diào)；miR-190b抑制劑組PTEN蛋白表達上調(diào)，PI3K和p-AKT/AKT下調(diào)。

A：空白對照組；B：miR-NC組；C：miR-190b模擬物組；D：miR-190b抑制劑組

表4 各組SK-NEP-1細胞集落形成數(shù)、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、凋亡率的比較(n=3)

1：空白對照組；2：miR-NC組；3：miR-190b模擬物組；4：miR-190b抑制劑組

表5 各組SK-NEP-1細胞中PTEN、PI3K蛋白相對表達量及p-AKT/AKT的比較(n=3)

3 討論

腎母細胞瘤是一種好發(fā)于兒童的胚胎性惡性腫瘤，是小兒外科手術(shù)中最常見的惡性實體瘤。盡管其診斷和治療的技術(shù)手段已迅速發(fā)展，但現(xiàn)有方法僅適用于具有一定腫瘤體積的患兒。隨著生物學(xué)標記的發(fā)現(xiàn)，miRNA被鑒定為多種癌癥的調(diào)節(jié)劑和標記物[7]。miRNA是一種非編碼RNA，可以與目標基因的3’UTR特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致目標蛋白表達水平的降低。miRNA可以作為幾種癌癥的診斷和預(yù)后生物標志物，也可以作為腫瘤生物學(xué)治療的潛在靶標[8]。已知，miR-140-5p通過直接靶向TGFBR1基因來緩解腎母細胞瘤的侵襲性發(fā)展[9]；miR-613通過靶向FRS2減弱腎母細胞瘤的增殖、遷移和侵襲[10]。miR-192、miR-194、miR-215、miR-200c和miR-141通過靶向WT9-14中的特定癌基因來抑制腫瘤的生長和進展[11]。miR-190b已被證實是一種致癌基因，可在多種癌癥中促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在人類肝細胞癌中，miR-190b通過IGF-1誘導(dǎo)胰島素抵抗[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在腎母細胞瘤組織中miR-190b高表達，與上述文獻報道一致；且過表達miR-190b可促進腎母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力，抑制細胞凋亡；敲低miR-190b表達可抑制腎母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力，促進細胞凋亡。因此，miR-190b可能調(diào)控腎母細胞瘤細胞的生物學(xué)行為。

研究[13]表明，PTEN/PI3K/AKT信號通路與惡性細胞的生長、增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)。PTEN為抑癌基因，且是miR-190b的靶標，miR-190b可能通過負調(diào)控PTEN在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生中發(fā)揮致癌作用[14]。而且PTEN/PI3K/AKT途徑被認為是肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的診斷和預(yù)后指標以及肝細胞癌的治療靶標[15]。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，PTEN是miR-190b的靶基因，且miR-190b負調(diào)控PTEN的表達，促進腎母細胞瘤的增殖。

綜上所述，miR-190b通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT信號通路來促進腎母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力，抑制其凋亡。