劉 希,鄭 娜，盧 宏

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州市第三人民醫(yī)院腎內(nèi)科 鄭州 450099

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是臨床上最常見的癡呆類型。腦內(nèi)出現(xiàn)淀粉樣斑塊形式及神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD典型的病理表現(xiàn)。AD早期患者常見近期記憶障礙及定向功能障礙，晚期患者則出現(xiàn)嚴重的認知功能下降及生活能力下降[1]，給患者及家屬帶來沉重的心理負擔和經(jīng)濟負擔。目前AD的臨床治療手段極為有限，膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊是FDA批準的為數(shù)不多的治療AD的藥物之一[2]，然而這些藥物無法逆轉(zhuǎn)AD的病程及挽救神經(jīng)細胞凋亡。因此，深入研究AD的發(fā)病機制，找出有效的AD治療手段勢在必行。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，具有神經(jīng)毒性作用的Aβ蛋白在腦內(nèi)異常聚集形成淀粉樣斑塊是導致AD發(fā)生的關鍵；Aβ單體是由淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid-beta precurser protein, APP)經(jīng)分泌酶的一系列剪切而形成。Aβ單體聚集形成二聚體或多聚體，從而在細胞外沉積形成淀粉樣斑塊。β位點APP剪切酶2(β-site cleavage enzyme 2,BACE2)最初被認為能夠處理APP并產(chǎn)生Aβ蛋白，是AD的“元兇”之一。我們前期的體外實驗[4]發(fā)現(xiàn)，BACE2通過吞噬溶酶體途經(jīng)降解，阻斷這一降解途徑不僅可提高內(nèi)源性BACE2的表達，而且能有效降低Aβ前體的產(chǎn)生。最近，Azkona等[5]的動物實驗證實了這一點, 在BACE2轉(zhuǎn)基因的小鼠體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)Aβ蛋白過量分泌、膽堿能神經(jīng)元喪失和記憶、學習能力的改變。以上結(jié)果提示增加內(nèi)源性或外源性BACE2蛋白的表達水平可降低Aβ蛋白的表達。

本研究構(gòu)建攜帶有人源性BACE2基因的病毒載體，通過側(cè)腦室注射法感染APP/PS1 dE9轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察小鼠腦內(nèi)BACE2表達及淀粉樣斑塊形成情況，探究外源性BACE2是否對AD疾病有腦保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑APP/PS1 dE9轉(zhuǎn)基因小鼠(3月齡，雄性，體重25～33 g)購于美國JAX Lab公司(編號：005864)。rAAV-hsn-WPRE-hGH-polyA質(zhì)粒(美國Addgene公司)。鼠抗Aβ單克隆抗體6E10(美國Biolegend公司)，羊抗兔BACE2-FLAG多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體AC15(美國Sigma-Aldrich公司)，二抗IgG(美國Invitrogen公司)。羊抗鼠APP C20(751-770)多克隆抗體(美國Sigma-Aldrich公司)，兔抗鼠BACE2單克隆抗體H-3(美國Santa Cruz公司)。

1.2BACE2表達質(zhì)粒的構(gòu)建與病毒包裝參照NCBI 提供的人類BACE2基因序列(Reference Sequence: NM_012105.4)，將HEK293來源的BACE2全長表達片段PCR擴增，由NcoⅠ、NheⅠ內(nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物后形成黏末端片段，插入rAAV-hsn-WPRE-hGH-polyA 質(zhì)粒，經(jīng)T4連接酶連接后形成AAV-hsn-BACE2-3×FLAG-WPRE-hGH-polyA病毒表達質(zhì)粒，空白對照質(zhì)粒無序列插入。AAV病毒的包裝由武漢樞密生物科技有限公司完成，獲得攜帶有人源BACE2基因的AAV-BACE2-FLAG和陰性對照AAV-FLAG。

1.3實驗分組與側(cè)腦室立體定位注射20只APP/PS1 dE9小鼠分為AAV-BACE2組和陰性對照組，每組10只。采用異氟烷吸入法深度麻醉小鼠，固定于立體定位儀。常規(guī)消毒頭部皮膚，沿矢狀縫以前囟前0.5 mm為起點作1 cm切口。以前囟為坐標原點，取坐標定位(-0.8,±1.2,-3.0)為注射標記點，用磨鉆將標記點鉆開，AAV-BACE2組和陰性對照組小鼠雙側(cè)側(cè)腦室分別用Hamilton微量進樣針緩慢注入滴度為1011個病毒顆粒/mL的相應病毒溶液4 μL。骨蠟封閉鉆孔，縫合皮膚。術(shù)畢，待麻醉清醒后將小鼠送還籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)。實驗過程中遵循ARRIVE指南及3R原則保障動物福利，本研究符合國際和國家頒布的關于生物醫(yī)學研究倫理要求。

1.4小鼠學習記憶能力的檢測病毒注射3個月后，2組小鼠行Morris水迷宮測試。Morris水迷宮為直徑120 cm、高50 cm的金屬水池，內(nèi)置直徑為10 cm的逃避平臺，淹沒于水面下1 cm。水溫由加熱器控制在(24±1) ℃?？臻g學習包括4 d連續(xù)定位航行實驗及第5天空間探索實驗。記錄每次小鼠從放入水中開始計時到搜索到淹沒于水面的平臺為止的時間為逃避潛伏期。如果小鼠在60 s內(nèi)未能搜索到平臺則記錄為60 s，然后研究者手動在10 s內(nèi)幫助小鼠找到水下隱藏的平臺。在第5天的探索實驗中，撤去水中平臺，將小鼠放入平臺對側(cè)象限，給與60 s自由搜尋時間，記錄小鼠穿過原先平臺所在象限區(qū)域的次數(shù)及游泳速度。

1.5海馬區(qū)淀粉樣斑塊和BACE2蛋白定位的檢測采用免疫熒光染色法。行為學測試后對小鼠行安樂死，置于冰上，PBS灌注取腦。40 g/L多聚甲醛固定24 h，經(jīng)300 g/L蔗糖溶液梯度脫水后OCT包埋，10 μm厚切片，體積分數(shù)10%的驢血清室溫孵育30 min封閉非特異性抗原。加一抗(Aβ抗體按1∶200稀釋，F(xiàn)LAG抗體按1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，加二抗(按1∶2 000稀釋)4 ℃孵育2 h。細胞核用含有DAPI的防光猝滅劑染色。用Leica TCSSP8激光共聚焦顯微鏡對染色后的切片進行觀察拍照，采用LAX影像處理軟件處理圖像。每隔100 μm取1張切片，每只小鼠取3張，每張觀察2個視野。計算每個視野中直徑大于20 μm的染色斑塊面積占視野總面積的百分比，取均值。

1.6海馬區(qū)APP和BACE2蛋白表達的檢測小鼠海馬組織經(jīng)RIPA裂解液裂解、勻漿，采用Bradford法檢測蛋白濃度后，加到70 g/L SDS-PAGE上進行電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至0.2 μm PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉溶液封閉，加一抗(APP和BACE2-FLAG抗體按1∶2 000稀釋； β-actin抗體按1∶5 000稀釋)4 ℃孵育過夜，加二抗(按1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，采用凝膠成像系統(tǒng)檢測。由Image J 分析，用目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0分析。2組小鼠腦組織海馬區(qū)淀粉樣斑塊面積百分比及APP蛋白表達的比較采用兩獨立樣本t檢驗；2組小鼠空間學習記憶能力比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.12組小鼠空間學習記憶能力比較2組小鼠的游泳速度無差異,說明小鼠的運動功能未受到明顯的影響。AAV-BACE2組小鼠第4天逃避潛伏期短于陰性對照組(表1)。AAV-BACE2組小鼠的平臺穿越次數(shù)為(3.0±0.4)，高于陰性對照組的(1.3±0.4)(t=2.940，P=0.009)。

2.22組小鼠腦組織海馬區(qū)淀粉樣斑塊面積百分比及APP蛋白表達的比較結(jié)果見圖1、2和表2。

表1 2組小鼠空間學習記憶能力比較

圖1 2組小鼠腦組織海馬區(qū)淀粉樣斑塊的表達

圖2 2組小鼠腦組織海馬區(qū)APP蛋白的表達

表2 2組小鼠腦組織海馬區(qū)淀粉樣斑塊面積百分比及APP蛋白表達的比較

2.3人源性BACE2蛋白在APP/PS1dE9小鼠腦組織的定位表達人源性BACE2蛋白在小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)域廣泛高表達且與神經(jīng)元特異標記Neun共定位(圖3)。Western blot 結(jié)果顯示AAV-BACE2組小鼠腦組織人源性BACE2表達較陰性對照組明顯升高(圖4)。

圖3 AAV-BACE2組小鼠腦組織BACE2蛋白的表達

圖4 2組小鼠腦組織BACE2蛋白表達的Western blot結(jié)果

3 討論

關于BACE2在AD發(fā)病機制中的作用一直存在激烈的爭論。 和APP一樣，BACE2基因同樣位于第21號染色體q22.3,且定位接近APP基因。在唐氏綜合征患者體內(nèi)BACE2表達提高，在中年后患者不可避免地出現(xiàn)AD的病理變化并表現(xiàn)出與AD相同的臨床表現(xiàn)[6-7]。作為天冬氨酸蛋白酶體BACE1的同系物，BACE2氨基酸序列與BACE1有75%相同。與BACE1在神經(jīng)細胞內(nèi)大量表達不同，BACE2在神經(jīng)細胞內(nèi)表達量很低或幾乎不表達[8]。有研究[9]證實，APP被BACE2剪切的位點位于Aβ的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，既不同于α位點，又不同于β位點，也和γ位點不同，產(chǎn)生APP C-末端片段為C80，因此被稱為θ位點。有研究[10]報道BACE2是一個條件性的β位點剪切酶，其剪切作用與APP的跨膜結(jié)構(gòu)域有密切聯(lián)系，且受到Clusterin蛋白密切調(diào)控。由于正常生理狀態(tài)下BACE2在腦內(nèi)表達量極低，作者推測提高內(nèi)源性的或引入外源性的BACE2可能阻斷BACE1對APP的剪切作用，從而降低Aβ的產(chǎn)生。前期的體內(nèi)實驗[6]在細胞層面印證了可以通過阻斷BACE2降解提高細胞內(nèi)源性BACE2的表達，抑制BACE1剪切APP，但通過抑制BACE2降解來提高內(nèi)源性BACE2實際難以實現(xiàn)。作者認為可通過轉(zhuǎn)基因手段提高體內(nèi)外源性BACE2的表達。

鑒于AD動物模型APP/PS1 dE9轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶的是人APP和PS1基因[11]，本研究創(chuàng)新性地將人源性BACE2基因轉(zhuǎn)入APP/PS1 dE9轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，使其過量表達，以更好地促進臨床前研究的轉(zhuǎn)化。此外，作者首次采用無害性且具有血腦屏障穿透性的血清型AAV病毒作為外源基因攜帶工具[12]。本研究結(jié)果表明提高BACE2的表達可以減少Aβ原料APP的表達，降低小鼠腦組織海馬區(qū)淀粉樣斑塊面積百分比。且行為學評價顯示，AAV-BACE2組小鼠顯示出較好的記憶和空間學習能力。以上結(jié)果表明引入人源性BACE2基因?qū)D動物模型有腦保護作用。

BACE2和BACE1一樣屬于天冬氨酸蛋白酶體家族成員，BACE2的底物不僅限于腦內(nèi)的APP，而且還有很多底物，例如BACE2可剪切胰島IAPP降低纖維化的胰島APP生成[13]，剪切黑色素細胞內(nèi)的細胞特異性黑色素前體蛋白生成黑色素等[14]，從而參與不同的生理過程。本研究首次將人源性BACE2基因引入成年動物腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)BACE2對APP有剪切作用，而BACE2在腦內(nèi)是否參與其他蛋白的剪切以及過表達BACE2對大腦生理功能是否存在不利作用需進一步研究。

綜上所述，本研究加深了對BACE2在AD發(fā)病機制中的認識，為AD的治療提供了新的治療靶點，可望為AD的基因治療提供理論基礎。