劉 開，余炳偉，李丹丹，陳 娜，曹必好

（1.華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】茄子（Solanum melongenaL.）是茄科茄屬常見的蔬菜作物，起源于東南亞的熱帶地區(qū)，在我國南北各地廣泛栽培，其根、莖、葉皆可入藥，果實中富含蛋白質、脂肪、維生素、龍葵堿和多種微量元素，既可用作蔬食，又具有降血壓、防治胃癌等功效［1］，營養(yǎng)價值與藥用價值極高。青枯病是茄子栽培中常見的細菌性土傳病害之一，其致病因子是青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），主要從根部侵入寄主植物的維管束部位并迅速擴散到地上部組織，對植株可造成毀滅性的破壞［2］。土溫20 ℃左右時為茄子青枯病的發(fā)病高峰期，微酸性土壤、連作以及氣溫急劇上升等都會導致青枯病嚴重發(fā)生［3］。我國茄子青枯病發(fā)生較為普遍，發(fā)病時嚴重影響茄子的產(chǎn)量和品質，導致茄子大面積減產(chǎn)減收［3］。但茄子抗青枯病的分子機理十分復雜，涉及多種因子調(diào)控，迄今仍未研究清楚。因此，深入開展茄子抗青枯病的相關研究顯得尤為重要。

【前人研究進展】植物WRKY 轉錄因子是一種具有多功能調(diào)控作用的轉錄因子，最早是從甘薯〔Dioscorea esculenta（Lour.）Burkill〕的SPF1基因中被鑒定出來的，因參與調(diào)控甘薯中的糖信號轉導過程而備受關注［4］。之后，陸續(xù)從野燕麥（Avena fatuaL.）、歐芹〔Petroselinum crispum（Mill.）Hill〕和水稻（Oryza sativaL.）的基因中成功鑒定出相應的WRKY基因，并詳細闡明了其在植物生長發(fā)育、信號轉導及其抗逆過程中發(fā)揮的重要作用［5-7］。近年來，關于WRKY 轉錄因子響應生物脅迫及非生物脅迫相關過程的研究多有報道［8］。研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaWRKY2和陸地棉GhWRKY33基因是響應干旱調(diào)節(jié)的關鍵基因，過表達TaWRKY2和GhWRKY33基因能夠分別增強小麥和轉基因擬南芥植株的抗旱性［9-10］；決登偉等［11］發(fā)現(xiàn)，玉米ZmWRKY25-like基因在響應鹽脅迫和低溫脅迫中上調(diào)表達；Sun 等［12］認為，山葡萄VaWRKY33基因在低溫脅迫下誘導表達以增強植株的耐寒性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，WRKY 轉錄因子在調(diào)控植物抗病性方面起關鍵作用。周茜茜等［13］研究發(fā)現(xiàn)，蘋果MdWRKY40基因通過介導水楊酸（Salicylic acid，SA）信號途徑正向調(diào)控蘋果對輪紋病菌的抗性；龍琴等［14］認為，過表達CsWRKY61能夠激活與生物脅迫和信號轉導相關的途徑，增強柑橘對潰瘍病的抗性；殷麗華等［15］研究發(fā)現(xiàn)，小豆VaWRKY33基因能夠響應豇豆單胞銹菌的誘導上調(diào)表達，并明顯提高小豆銹病的抗性；在擬南芥抗病性研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtWRKY61和AtWRKY70基因分別正向調(diào)控蕪菁皺葉病毒和丁香假單胞菌的抗性［16-17］；王丹等［18］研究發(fā)現(xiàn)，VqWRKY53通過促進SA 和芪類物質的合成，可增強中國野生毛葡萄植株的抗病性。

【本研究切入點】目前已有研究在茄屬植物歐白英（Solanum dulcamara）的基因組中克隆得到WRKY基因，并對其相應的生物信息學功能進行了分析［19］，但與茄子青枯病抗性相關的研究仍鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過克隆與茄子青枯病抗性相關的SmWRKY65基因，對其進行生物信息學、亞細胞定位及時空表達模式分析，并以清水和pTRV2空載為對照，構建pTRV2-SmWRKY65載體，探究SmWRKY65在茄子抗病植株（E-31）中沉默后對茄子青枯病的響應情況，以期為茄子青枯病抗病機理的相關研究提供理論基礎，為茄子青枯病抗性品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茄子抗病材料（S.melongenaL.E-31，R）和感病材料（S.melongenaL.E-32，S）由曹必好教授提供。青枯菌致病菌株從感病材料中分離得到，VIGS 載體構建所需的煙草脆裂病毒載體pTRV-1和pTRV-2由華南地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室保存，DH5α 大腸桿菌轉化菌株和GV3101 轉農(nóng)桿菌菌株均購自生工生物科技有限公司。

RNA 提取試劑盒Trizol 購自北京華越洋生物科技有限公司，PCR 反應試劑盒2×HiFiTaq PCR StarMix、快速DNA 膠回收試劑盒StarPrep 和快速質粒小提試劑盒StarPrep 均為GenStar 產(chǎn)品，反轉錄試劑盒HiScript?ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR 和實時熒光定量PCR 試劑盒a SYBR Premix Ex Taq kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 茄子不同組織部位總RNA 的提取與cDNA 的合成 在茄子幼苗三葉期時分別采集茄子根、莖、葉部位的樣品，用錫箔紙包裹并迅速放入液氮中，每個樣品3 次重復并做好標記，之后采用Trizol 試劑盒的方法分別提取茄子根、莖、葉的RNA，并采用HiScript?ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR 試劑盒進行逆轉錄反應合成cDNA，詳細步驟參照說明書。cDNA 合成PCR 反應體系10 μL，反應程序為：25 ℃，10 min；50 ℃，30 min；85 ℃，5 min。

1.2.2SmWRKY65序列的獲得與基因克隆 本課題組前期通過轉錄組測序得到WRKY65基因序列（登錄號：Sme2.5_00423.1_g00013.1）。利用Primer 5.0 軟件設計引物（SmWRKY65-F、SmWRKY65-R，表1），以茄子葉片cDNA 為模板通過PCR（10 μL 體系）擴增得到SmWRKY65基因序列。PCR 反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，32 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物的特異性，將條帶明亮、大小與預期一致的條帶采用StarPrep 快速DNA 膠回收試劑盒進行純化。

1.2.3SmWRKY65的生物信息分析 利用ExPASy ProtParam tool（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）對SmWRKY65 蛋白理化性質進行分析；使用ProtScale（http://ca.expasy.org/tools/protscale.html）和SOPM 工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=np-sa_sopma.html）分別預測SmWRKY65 蛋白親/疏水性和二級結構類型；使用NCBI CD Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi）和PredictProtein 工具（http://www.predictprotein.org/）對SmWRKY65 蛋白序列進行二級結構的結構域和結合位點預測；通過NCBI Blast 在線比對工具，檢索SmWRKY65同源性基因，將相似性較高的同源性序列下載后，利用MEGA 7.0 軟件UPGMA 法構建進化樹。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物的連接與SmWRKY65 質粒的提取 將上述1.2.2 中的PCR 產(chǎn)物連接pMD 19-T載體（pMD 19-T 載體:Solution I :回收產(chǎn)物=0.5 μL :4.5 μL :5 μL），之后轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，用pMD19-T 通用引物檢測陽性菌落，委托廣州擎科生物技術有限公司進行測序，確定重組子。挑取重組子進行擴搖，采用StarPrep 快速質粒小提試劑盒提取SmWRKY65 質粒，具體步驟參照說明書。

1.2.5SmWRKY65的時空表達模式分析 利用Primer 5.0 軟件設計SmWRKY65熒光定量引物（q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R，表1），以茄子內(nèi)參18S rRNA（18S rRNA-F、18S rRNA-R，表1）為對照，采用a SYBR Premix Ex Taq Kit 試劑盒對茄子根、莖、葉組織進行SmWRKY65實時熒光定量（qRT-PCR）表達量的測定，詳細步驟參照說明書。再分別以茄子抗病和感病植株為材料，在茄子苗3 葉期接種青枯病菌以分析SmWRKY65在茄子抗病和感病植株中的表達情況，并在接種后0、3、6、9 h 4 個時間段分別采集抗病、感病植株葉片，以茄子內(nèi)參18S rRNA（18S rRNA-F、18S rRNA-R，表1）為對照，采用SmWRKY65熒光定量引物（q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R，表1）進行qRT-PCR 表達量的測定，以分析SmWRKY65在抗病和感病材料中的表達量差異。qRT-PCR 程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸35 s，35 個循環(huán)。每個樣品3 次生物學重復，最后取平均值進行分析，基因的相對表達量應用2-ΔΔCt 方法進行分析［20］。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 構建亞細胞定位載體及轉化洋蔥 利用Primer 5.0 軟件設計SmWRKY65亞細胞定位引物（SmWRKY65-GFP-EB-F、SmWRKY65-GFPEB-R，表1），通過PCR 反應克隆SmWRKY65亞細胞定位目的片段。使用EcoR I 和BamH I 酶對亞細胞定位載體pC018 和目的片段進行雙酶切并連接成重組質粒SmWRKY65-GFP，測序后將重組質粒轉入農(nóng)桿菌GV3101，轉化洋蔥內(nèi)表皮組織，3 d 后在顯微鏡下觀察亞細胞定位結果。

1.2.7 VIGS 載體的構建 通過在線工具（vigs.solgenomics.net）尋找特異性的VIGS 載體區(qū)域，根據(jù)pTRV2載體多克隆位點所包含的酶切位點，設計1 對特異性引物（pTRV2-WRKY65-F、pTRV2-WRKY65-R，表1），以茄子葉片cDNA為模板進行PCR 反應獲得長度為250 bp 左右的特異性PCR 產(chǎn)物，用雙酶切（EcoR I 和BamH I）法將產(chǎn)物片段連接到pTRV2載體上，之后轉入大腸桿菌DH5α，陽性單菌落進行PCR 菌落篩選，送廣州擎科生物科技有限公司測序，確定重組子。將陽性單菌落進行擴搖，提取重組質粒（pTRV2-SmWRKY65）后轉入農(nóng)桿菌GV3101 用于侵染。

1.2.8 農(nóng)桿菌侵染茄子幼苗 將抗病和感病茄子種子分別播種在含泥炭和珍珠巖的混合基質中，于25 ℃、16 h 光照和8 h 黑暗的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。當茄子幼苗長至3～4 片真葉時，吸取含有重組質粒（pTRV2-SmWRKY65）的陽性菌落擴搖后配制成侵染液，并將分離到的青枯菌采用傷根斷根法對茄子幼苗進行侵染，青枯菌的分離與接種參照曹必好等［21］的方法，每組15 株，3 次重復，之后在16 ℃、60 %的相對濕度下暗處理1 d，隨后置于培養(yǎng)室中生長。3 d 后采用斷根法接種青枯病菌，觀察其表型變化并拍照，2 周后調(diào)查統(tǒng)計病情指數(shù)，方法參照Chen 等［22］，之后通過qRT-PCR 法測定pTRV2-SmWRKY65沉默植株表達量。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0 進行t檢驗，采用Excel 2010 制圖。

2 結果與分析

2.1 SmWRKY65 基因的克隆

以茄子葉片cDNA 為模板，通過PCR 擴增得到948 bp 的SmWRKY65片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示目的條帶與預期結果一致（圖1），將目的條帶切膠回收、純化、測序。對SmWRKY65測序序列與WRKY65原始序列（登錄號：Sme2.5_00423.1_g00013.1）在DNAMAN 8.0工具上進行比對，結果顯示同源性為88.06%，表明在茄子中成功克隆了SmWRKY65（圖2）。

圖1 SmWRKY65 電泳結果Fig.1 Electropherogram result of SmWRKY65

2.2 SmWRKY65 蛋白的生物信息學分析

SmWRKY65 蛋白理化性質分析結果顯示，該基因開放閱讀框為834 個核苷酸序列，編碼277 個氨基酸殘基，蛋白相對分子量大小為30155.21 ku，等電點為5.51，分子式為C1304H1998N30O430S13，原子總量為4115，預測該蛋白屬于親水性蛋白。對SmWRKY65 蛋白的二級結構進行預測，結果顯示，其主要由不規(guī)則盤繞結構（72.92%）、α-螺旋（12.27%）、延伸鏈（11.91%）和β-轉角（2.89%）等結構元件組成（圖3）。預測該蛋白屬于WRKY 家族，在71～131 區(qū)域具有1 個含60 個氨基酸的WRKY 保守域，可以特異結合DNA 序列（T）（T）TGAC（C/T），具有DNA 結合位點3 個、蛋白結合位點3 個、核苷酸多肽鏈結合位點2 個、大分子結合區(qū)域7 個，主要多集中在WRKY 家族的保守結構域內(nèi)，預測該基因定位于細胞核中（圖4）。通過NCBI 上Blast 在線比對工具，將檢索到的12條與SmWRKY65同源性較高的基因進行多序列比對，使用MEGA 7.0.21 軟件構建進化樹，結果表明，茄子SmWRKY65與馬鈴薯、番茄的WRKY65同源性最高（圖5）。

2.3 SmWRKY65 的時空表達模式和亞細胞定位分析

以茄子葉片cDNA 為模板，通過PCR 檢測SmWRKY65熒光定量引物的特異性，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示在250 bp 左右有1 條明亮且符合預期的條帶（圖6A），說明引物特異性較好，可用于后續(xù)試驗。對茄子根、莖、葉不同組織部位表達量的分析結果顯示，SmWRKY65在茄子根組織部位中的表達量最高，在葉中的表達量次之，莖中最低（圖6B）。在茄子苗期接種青枯病菌后0、3、6、9 h 4 個時間段分別采集抗病、感病植株葉片進行實時熒光定量分析，結果表明，SmWRKY65在抗病和感病材料中的表達量均隨接種時間延長逐漸升高，9 h 時達到最高，且在抗病材料中的表達水平明顯高于在感病材料中的表達水平（圖6C），說明SmWRKY65響應茄子青枯病抗性相關基因的表達。

使用EcoR I 和BamH I 酶對亞細胞定位載體pC018 和亞細胞定位引物成功克隆出的PCR 片段進行雙酶切，并連接成大小為831 bp 的重組質粒SmWRKY65-GFP（圖7A），將重組質粒轉化農(nóng)桿菌后轉化洋蔥表皮細胞，在共聚焦顯微鏡下觀察到SmWRKY65定位在細胞核中表達（圖7B），這與預測結果一致。

圖6 茄子不同組織及抗感病植株中SmWRKY65 的表達分析Fig.6 SmWRKY65 expression of different tissues and disease-resistant and disease-susceptible plants of eggplant

圖7 SmWRKY65 亞細胞定位分析Fig.7 Subcellular localization analysis of SmWRKY65

2.4 SmWRKY6 沉默在抗病茄子中響應青枯病的情況

2.4.1pTRV2-SmWRKY65載體構建結果 以茄子葉片為材料提取RNA 并通過逆轉錄反應合成cDNA，再以cDNA 為模板，利用構建VIGS 載體所設計的特異性引物進行PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，獲得長度為242 bp 的PCR 產(chǎn)物（圖8A），將產(chǎn)物片段和pTRV2 載體同時用EcoR I和BamH I 進行雙酶切后成功將SmWRKY65連接到pTRV2載體上獲得重組質粒，經(jīng)測序保證連接片段和讀碼方向正確后轉入農(nóng)桿菌GV3101。從陽性菌落檢測結果來看，與pTRV2（圖8B1）空載相比，pTRV2-SmWRKY65（圖8B2）載體構建成功。

圖8 pTRV2-SmWRKY65 載體構建Fig.8 pTRV2-SmWRKY65 vector construction

2.4.2 青枯病菌接種VIGS 沉默植株 為了驗證pTRV2-WRKY65沉默植株對茄子青枯病的響應情況，在3～4 片真葉時，對茄子抗病植株接種青枯病病原菌。接種7 d 后觀察到接種清水的葉片均沒有表現(xiàn)出明顯的萎蔫癥狀，接種pTRV2空載的植株僅有1 片葉片出現(xiàn)萎蔫，而接種pTRV2-WRKY65的15 株植株幾乎全部表現(xiàn)出萎蔫癥狀；接種2 周后，對pTRV2-WRKY65植株進行病情指數(shù)調(diào)查，結果（表2）表明，SmWRKY65基因被沉默后影響了抗病材料對青枯病的抵御能力，即表現(xiàn)為感病癥狀。pTRV2-SmWRKY65實時熒光定量檢測結果（圖9）顯示，與清水和pTRV2空載相比，pTRV2-SmWRKY65表達量明顯下降。

表2 VIGS 沉默植株的病情指數(shù)統(tǒng)計Table 2 Statistics of disease index of VIGS silent plants

圖9 VIGS 沉默植株的表型（A）及qRT-PCR 分析（B）Fig.9 Phenotype（A）and qRT-PCR analysis（B）of VIGS silent plants

3 討論

茄子是我國南北各地廣泛栽培的夏秋季重要蔬菜之一，在我國的栽培歷史悠久，種植面積大，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。但茄子易受青枯病侵襲，尤其在我國南方地區(qū)，其病原菌適應性強、分布廣泛、繁殖速度較快，常規(guī)方法難以有效防治，而抗病育種可以有效防御病菌的危害，能較大幅度提高茄子的產(chǎn)量和品質［2,23］。近年來，研究人員在提高茄子青枯病抗性及抗病品種選育方面作了較多努力。邵欣欣［24］在茄子青枯病抗性研究中發(fā)現(xiàn)，ERF 轉錄因子參與調(diào)控茄子抗青枯病的信號途徑；肖熙鷗等［25］研究認為，SA 信號途徑中MAPK6、MKK2、NPR1、PAD4等基因能夠正向調(diào)控茄子青枯病的抗性；李威等［26］研究發(fā)現(xiàn)，1.5～2.0 mmol/L 的硅濃度處理可有效提高快圓茄青枯病的抗性；Qiu 等［27］認為，過表達SmMYB44可誘導茄子中亞精胺相關基因（SmSPDS）的表達，促進亞精胺的合成與積累，從而增加對茄子青枯病的抗性。此外，廣州市農(nóng)業(yè)科學研究院經(jīng)過多年研究選育出的翡翠綠2 號青茄新品種在大田抗病性鑒定中表現(xiàn)為中抗青枯?。?8］，與廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所聯(lián)合選育出的紫榮6 號和玫瑰紫花茄均為抗青枯病的優(yōu)質茄子新品種［29-30］。

研究表明，在生物脅迫下，植物體內(nèi)會通過信號傳導途徑和防御反應作出應激防衛(wèi)，而轉錄因子在這一系列反應中起關鍵作用［31］。近年來有關WRKY 轉錄因子在植株抗病性上的研究成為一個熱門話題［32］。已有研究報道，WRKY 轉錄因子涉及調(diào)控與青枯病抗性相關的信號轉導過程。王鵬飛等［33］研究發(fā)現(xiàn)，野生花生AdWRKY37基因在受到青枯病菌液脅迫誘導后表達量明顯升高，并推測該基因可能通過介導水楊酸（Salicylic acid，SA）和茉莉酸（Jasmonic acid，JA）途徑參與青枯病抗病相關過程的調(diào)控；Dang 等［34］認為，CaWRKY27 轉錄因子通過調(diào)節(jié)SA、JA 和內(nèi)皮素（Endothelin，ET）介導的信號通路，可增強煙草對青枯菌的抗性；Liu 等［35］發(fā)現(xiàn)，在煙草中過表達NtWRKY50能夠促進SA 合成，從而增強植株對青枯病的抗性；Dang 等［36］在辣椒抗病育種的研究中發(fā)現(xiàn)，CaWRKY41 轉錄因子能夠提高辣椒對青枯菌的抗性。然而，有關WRKY 轉錄因子在茄子青枯病抗性中的相關研究還鮮見報道。本研究以茄子葉片cDNA 為模板成功克隆了SmWRKY65基因，與茄子數(shù)據(jù)庫中原始WRKY65序列比對同源性為88.06%，序列差異性的產(chǎn)生可能與PCR 擴增過程中單核苷酸堿基變異及引物二聚體的形成有關。實時熒光定量分析結果表明，SmWRKY65在茄子抗病和感病植株中均響應青枯病的誘導，其表達量在接種青枯病菌后0、3、6、9 h 4 個時間點不斷升高，且SmWRKY65在茄子抗病材料中的表達水平明顯高于感病材料，說明SmWRKY65可能涉及茄子青枯病抗病的調(diào)節(jié)過程。在抗病茄子（E-31）植株中接種青枯菌的分析結果顯示，與清水和pTRV2空載相比，SmWRKY65沉默植株表現(xiàn)出明顯的萎蔫、易感癥狀，且qT-PCR 分析表明SmWRKY65在茄子中的表達量較清水和pTRV2空載明顯降低，這表明SmWRKY65沉默后可能抑制了茄子青枯病抗病信號途徑中相關基因的表達，從而降低了茄子植株對青枯病原菌的抗性。

4 結論

本研究成功克隆了SmWRKY65基因，與茄子數(shù)據(jù)庫中原始WRKY65序列的同源性為88.06%，該基因開放閱讀框為834 個核苷酸序列，編碼277 個氨基酸殘基，在71～131 區(qū)域包含1 個含60 個氨基酸的WRKY 保守域，定位于細胞核中，與馬鈴薯、番茄WRKY65的同源性最高。時空表達分析發(fā)現(xiàn)，SmWRKY65在茄子根組織中的表達量最高，葉中次之，莖中最低。實時熒光定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)，SmWRKY65在茄子抗病和感病材料中均響應青枯病菌的誘導上調(diào)表達，且在抗病材料中的表達水平明顯高于感病材料；VIGS 結果表明，接種pTRV2-SmWRKY65植株的葉片表現(xiàn)出明顯的萎蔫癥狀，結合qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，pTRV2-SmWRKY65表達量較對照明顯下降，表明SmWRKY65沉默后茄子抗青枯病的能力下降，說明SmWRKY65可能涉及茄子青枯病抗病相關過程的調(diào)控。