陶志云，徐文娟，施祖灝，朱春紅，章雙杰，宋衛(wèi)濤，劉宏祥，李慧芳*

(1. 江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚州，225125；2. 譜尼測試集團江蘇有限公司，江蘇 蘇州，215000)

鴨疫里默氏菌病是侵害水禽和其它鳥類的一種急性敗血性傳染病，以全身漿膜面發(fā)生纖維素性炎癥為特征，其發(fā)病及死亡率高，急性病變多以死亡為轉(zhuǎn)歸，慢性病例多會耐過，但會失去經(jīng)濟價值[1-3]，因此，該病已成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的一種重要傳染病。目前，鴨疫里默氏菌病的臨床診斷主要的方法是血清學(xué)診斷(酶聯(lián)免疫吸附實驗和間接免疫熒光試驗)和常規(guī)PCR檢測等。由于鴨疫里默氏菌血清學(xué)眾多，目前已報道的有21種血清型[4-7]，檢測難度較大。SYBRGreen I實時熒光定量PCR使用特異性引物和SYBR Green I核酸染料，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程，無需電泳，以其速度快、靈敏度高、特異性強、自動化程度高、能定量等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于病原體檢測[8-10]。本研究建立一種檢測鴨疫里默氏菌的熒光定量PCR方法，根據(jù)鴨疫里默氏菌16S rRNA保守序列設(shè)計特異性引物，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，建立檢測鴨疫里默氏菌的熒光定量PCR方法，并將該方法用于鴨疫里默氏菌感染后在組織中分布檢測，為鴨疫里默氏菌感染機制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株培養(yǎng) 試驗所用鴨疫里默氏菌菌株為ATCC11845標(biāo)準(zhǔn)株，菌株購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。凍存的菌株經(jīng)活化后挑取單克隆，加入5 mL含5%血清的TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)培養(yǎng)液中，37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)，取2 mL菌液加入到200 mL的含有5%血清的TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)培養(yǎng)液中，繼續(xù)37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。將所得菌液1 000 rpm/min離心10 min后去上清，用生理鹽水將沉淀稀釋為4×106，4×107，4×108，4×109，4×1010，4×1011cfu/mL，備用。

1.1.2 試驗鴨 試驗鴨來源于高郵鴨集團，為健康雛鴨，相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)至30日齡時進行分組。

1.1.3 鴨疫里默氏菌人工感染試驗及樣品采集 每只鴨皮下注射0.5 mL菌液，對照組鴨注射相同劑量的生理鹽水，每組15只，人工感染后連續(xù)觀察14 d，統(tǒng)計死亡率，計算半數(shù)致死量，確定適宜的感染劑量。

采用1×109cfu/mL的鴨疫里默氏菌人工感染健康的30日齡育成期高郵鴨150只，按照該品種鴨國家標(biāo)準(zhǔn)要求飼養(yǎng)，隨機分為2組(對照組和感染組)，在感染的1 d，2 d，3 d，5 d，9 d和14 d，屠宰后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及腦組織，分別用凍存管儲存于液氮中，用于細菌RNA提取。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(HB4114，青島海博生物有限公司)，血平皿(9 cm，YB3400071，上海鈺博生物科技有限公司)，國產(chǎn)血清(四季青，11011-8611，北京索萊寶科技有限公司)，TRIzol-A+總RNA提取試劑(DP421)、RealUniversal彩色熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Green，F(xiàn)P201，天根生化科技(北京)有限公司)、FastKing一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑(KR118，天根生化科技(北京)有限公司)、pGM-T克隆試劑盒(VT302-02，天根生化科技(北京)有限公司)、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP118，天根生化科技(北京)有限公司)、Universal DNA純化回收試劑盒(DP214，天跟生化科技(北京)有限公司)。高速冷凍離心機(Eppendorf centrifuge 5417R)，紫外分光光度計(GeneQuant II Pharmacia Biotech)，PCR儀(Eppendorf mastercycler)，凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 3500R)，熒光定量PCR儀(Stratagene Mx3000P)。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA提取和質(zhì)量檢測 按照TRNzol-A+總RNA提取試劑說明書提取組織總RNA，用適量RNA-free水溶解提取的RNA沉淀，通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測RNA的純度和含量。

1.3.2 cDNA第一鏈的合成 參照FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為：模板RNA 1 μg，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，加水至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42 ℃ 孵育15 min，95 ℃孵育3 min，反應(yīng)結(jié)束后取出逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置冰上進行后續(xù)試驗或冷凍保存。

1.3.2 引物設(shè)計、目的片段克隆及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備 根據(jù)鴨疫里默氏菌16S rRNA基因信息(GenBank登錄號為：NR_026025.1)，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物對。上游引物序列F: 5'-ACTGCCGTTGATACTGCTA-3'，下游引物序列R: 5'-TCTAATCCTGTTCGCTCCC-3'，目的序列長度約163 bp。PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35個循環(huán))；72 ℃ 10 min。擴增獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收純化試劑盒回收純化后按pGM-T載體試劑盒說明書連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細胞，涂板后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子于含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 搖床180 r/min振搖培養(yǎng)過夜，菌液PCR鑒定目的片段是否連接到質(zhì)粒中。將鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.3.3 熒光定量PCR反應(yīng) SYBR Green I法進行熒光定量PCR擴增，20 μL反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，2×RealUniversal PreMix 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：① 95 ℃ 15min；② 95 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)；③ 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，同時設(shè)陰性對照，每個樣品重復(fù)3次。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將測序驗證正確的含鴨疫里默氏菌16S rRNA基因的質(zhì)粒，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取陽性質(zhì)粒，用分光光度計測其濃度后，做10倍梯度稀釋，以10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8濃度質(zhì)粒作為模板，進行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件同上，設(shè)置3個重復(fù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)=標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度/標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子量×6×1014，其中，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子量=標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒堿基數(shù)×324。根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將得到的未知樣本的Ct值代入線性方程即可計算出待測樣品中鴨疫里默氏菌的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量鴨疫里默氏菌人工感染的死亡率

試驗設(shè)置了2×106，2×107，2×108，2×109，2×1010，2×1011cfu/只 6個濃度梯度，記錄死亡情況，見表1。采用累計法(Reed-Muench法)計算LD50，死亡率每增加一個百分點，劑量對數(shù)增加：(11.301-10.301)/(86.667-46.667)=0.025，死亡率從46.67%增加到86.67%，劑量對數(shù)增加0.025×(50-46.667)=0.075，LogLD50=10.301+0.075=10.386，取反對數(shù)，LD50為2.432×1010。

表1 人工感染鴨疫里默氏菌劑量及死亡情況Table 1 The dose and mortality of Riemerella anatipestifer infection

2.2 鴨疫里默氏菌熒光定量PCR檢測方法的建立

2.2.1 熒光定量PCR產(chǎn)物檢測 經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測，熒光定量PCR擴增產(chǎn)物(圖1A)和含有質(zhì)粒的菌液PCR擴增后產(chǎn)物(圖1B)，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物片段長度約163 bp(見圖1)。

圖1 16S rRNA基因片段PCR擴增圖

2.2.2 熒光定量PCR熔解曲線、擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖2A可見，鴨疫里默氏菌16S rRNA基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒經(jīng)10倍梯度稀釋，定量PCR反應(yīng)后獲得的熔解曲線峰形單一，無雜峰；圖2B的擴增曲線為S形，圖2C的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度(R2)為0.997，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣本在同一試驗中運行，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.319×LOG(X)+33.83。

圖2 鴨疫里默氏菌16S rRNA基因擴增的熔解曲線(A)，擴增曲線(B)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(C)Fig.2 Melting curve (A), Amplification curve (B) and standard curve (C) of Riemerella anatipestifer 16S rRNA gene

2.3 鴨疫里默氏菌在鴨組織中的分布規(guī)律

采用建立的熒光定量PCR方法，對鴨疫里默氏菌感染后1 d，2 d，3 d，5 d，9 d和14 d的脾臟，腦，心臟，肺臟，肝臟中的載菌量進行了檢測，見表2。結(jié)果表明在人工感染后1 d，幾種組織中均有鴨疫里默氏菌定殖，在2 d時顯著增加，達高峰，3 d時細菌定殖量快速下降，但在心臟和腦中仍檢測到大量細菌定殖，5 d后細菌定殖大幅減少，在肺和肝中未檢測到，但在腦中仍有大量細菌定殖。

表2 鴨疫里默氏菌人工感染后不同組織中的載菌量Table 2 Amount of bacteria in tissues during Riemerella anatipestifer infection

3 討 論

目前已有較多鴨疫里默氏菌人工感染試驗的報道，如，I型鴨疫里默氏桿菌菌株人工感染試驗中，采用2×108cfu/只經(jīng)嗉囊和氣管注射感染途徑感染1周齡的雛鴨，成功建立了鴨疫里默氏菌人工感染模型[11]；用3×109cfu/只經(jīng)頸部皮下注射13日齡的天府肉鴨進行人工感染試驗[12]；用2×108cfu/只經(jīng)腿部皮下注射10日齡四川麻鴨，在接種后168 h內(nèi)發(fā)病率80%[13]。以上試驗表明，由于鴨疫里默氏菌菌株、感染途徑、鴨的品種和日齡等的不同，感染劑量也不同，應(yīng)針對不同的菌株和試驗動物摸索適宜的感染劑量。因此，本文通過皮下注射，設(shè)置了鴨疫里默氏菌ATCC11845標(biāo)準(zhǔn)株的不同感染劑量感染30日齡高郵鴨試驗，確立了鴨疫里默氏菌的LD50為2.432×1010cfu/只。為了達到好的感染效果，同時減少病死率，選擇1×109cfu/只為后續(xù)試驗的人工感染劑量。

SYBRGreen I熒光定量PCR法以無需電泳，速度快、靈敏度高、特異性強、自動化程度高、能定量等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于病原體檢測[14-16]。本試驗中所設(shè)計引物經(jīng)PCR擴增后可獲得單一的清晰條帶，經(jīng)測序和BLAST比對與相應(yīng)的目的基因的一致性達到100%，說明所設(shè)計的引物正確。實時熒光定量PCR擴增的熔解曲線可以看出，擴增產(chǎn)物在熔解溫度上為一特異性的單峰，無其它雜峰，說明該引物的特異性強，可以準(zhǔn)確定量。擴增曲線為“s”形，符合實時熒光定量PCR的要求。一般認為當(dāng)R2>0.98時，所建立的熒光定量反應(yīng)才更加可靠和穩(wěn)定[17]。本試驗中16S rRNA基因的熒光定量PCR反應(yīng)相關(guān)系數(shù)為0.997，說明所建立的該基因的熒光定量PCR方法穩(wěn)定可靠。

已有研究表明，在自然感染的病例中，鴨心、肝、腦三種組織中荷載量由高到低依次為腦，心，肝[18]。本文對人工感染鴨疫里默氏菌后在組織中的分布情況做了分析，結(jié)果表明組織中的鴨疫里默氏菌載菌量由高到低依次為腦，心，脾，肺，肝，該結(jié)果與自然感染結(jié)果一致。進一步對鴨疫里默氏菌感染的時間特征做了分析，表明鴨疫里默氏菌在幾種組織中均在感染后2 d達定殖高峰，這與臨床觀察的感染后2 d臨床癥狀最為嚴重相一致。在感染的1 d到14 d在腦中均可檢測到鴨疫里默氏菌，這與鴨疫里默氏菌感染可引起站立不穩(wěn)，頭頸震顫，角弓反張，抽搐等腦神經(jīng)癥狀相符，明確了鴨疫里默氏菌可以突破腦屏障，引起腦損傷。感染后5 d，鴨疫里默氏菌在脾臟，心，肺，肝中的載菌量很少或檢測不到，這說明在5 d時，由于機體的抗感染免疫作用，鴨疫里默氏菌大幅減少。