謝曉佩,王 琦,孔新平,吳慶俠*,董海龍,李家奎，曾江勇

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)科院 畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850000)

近年來，益生菌(Probiotics)制劑受到了眾多關(guān)注并獲得了廣泛的研制及應(yīng)用，以避免使用抗生素帶來的DNA污染、細(xì)菌耐藥性、甚至超級(jí)細(xì)菌等危害。2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界糧農(nóng)組織(FAO)將益生菌定義為攝入一定數(shù)量后對(duì)宿主健康有益的活菌[1]。益生菌具有改善動(dòng)物胃腸道平衡、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料利用率、增進(jìn)動(dòng)物健康、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)和養(yǎng)殖環(huán)境等作用[2]。由于飼料加工貯藏運(yùn)輸過程中需要對(duì)菌體進(jìn)行滅活處理，所以提高益生菌制品的穩(wěn)定性很重要。芽孢菌因特殊的結(jié)構(gòu)決定了其特殊的物理性質(zhì)，抗逆性強(qiáng)，存活率高，易生長(zhǎng)，是無毒、無殘留、無污染的綠色添加劑。枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，具有廣闊的發(fā)展前景和巨大的生態(tài)效益和社會(huì)效益[3]。牦牛生長(zhǎng)環(huán)境特殊，牦牛用益生菌最好分離自健康牦牛[4]。本試驗(yàn)采集西藏林芝健康牦牛的新鮮糞便，分離并篩選出具備較好耐受性的牦牛源枯草芽孢桿菌，為牦牛專用益生菌制劑的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)備與試劑

Milli-O○RAdvantage A10○R超純水系統(tǒng)-超純水機(jī)，高壓滅菌鍋，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，生化培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，磁力攪拌器(購(gòu)自金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司)，超凈工作臺(tái)(購(gòu)自江蘇蘇靜集團(tuán))，離心機(jī)(購(gòu)自美國(guó)Thermo公司)，搖床(購(gòu)自河南兄弟儀器設(shè)備有限公司)，顯微鏡(購(gòu)自日本OLYMPUS公司)，梯度PCR儀(購(gòu)自日本TAKARA公司)，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)(購(gòu)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)等。

MRS培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，普通營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基，各濃度酒精，3%雙氧水，牛肉膏，Kovac氏試劑，瓊脂糖，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，二甲苯等由西藏農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)樓提供?？焖俑锾m氏染色液，芽孢染色液，細(xì)菌藥敏紙片，糖類生化反應(yīng)管，明膠液化培養(yǎng)基，豬膽鹽，硫化氫微量發(fā)酵管，Simmons枸櫞酸鹽等由杭州濱和微生物試劑有限公司提供。通用引物由武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司提供。

1.2 樣品的采集和處理

適量采取健康牦牛的新鮮糞便，分裝加入到經(jīng)滅菌冷卻后的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于搖床中37 ℃預(yù)培養(yǎng)15 min，然后經(jīng)80 ℃水浴處理15 min，每5 min震蕩搖勻一次[5-6]，可初步篩選過濾掉部分雜菌。然后于離心機(jī)中以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上層液體，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于搖床中37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。

1.3 枯草芽孢桿菌的分離

用移液槍吸取適量營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，用接種針分別涂布于選擇培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。挑選在培養(yǎng)基上形態(tài)疑似枯草芽孢桿菌的單菌落，涂片，染色，顯微鏡觀察。經(jīng)多次分離培養(yǎng)，得出牦牛源枯草芽孢桿菌在選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況最好。之后從選擇培養(yǎng)基上挑取疑似枯草芽孢桿菌的單個(gè)菌落，多次接種于選擇培養(yǎng)基上劃線分離，純化培養(yǎng)。

1.4 枯草芽孢桿菌的增菌培養(yǎng)

經(jīng)純化培養(yǎng)和多次涂片染色鏡檢后，挑取選擇培養(yǎng)基上疑似枯草芽孢桿菌的單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、選擇液體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。經(jīng)多次培養(yǎng)，得出枯草芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況最好。之后顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)，確定液體培養(yǎng)物為純培養(yǎng)物，不含雜菌。

1.5 枯草芽孢桿菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 做細(xì)菌抹片，分別采用革蘭氏染色、孔雀石綠染色、芽孢染色，置油鏡觀察。

1.5.2 生化鑒定 根據(jù)《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》實(shí)驗(yàn)七“細(xì)菌的生化試驗(yàn)”對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)的生理生化鑒定[7]。(1)糖類分解試驗(yàn)：用移液槍吸取枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養(yǎng)物，分別接種至葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、蕈糖、菊糖等糖類生化反應(yīng)管中，37 ℃培養(yǎng)24 h。(2) 吲哚試驗(yàn)：以接種環(huán)將選擇培養(yǎng)基上枯草芽孢桿菌的純培養(yǎng)物接種于滅菌處理后的Dunham氏蛋白胨水溶液中，37 ℃培養(yǎng)48 h，向培養(yǎng)液中加入2～3 mL二甲苯，搖勻，靜置片刻，然后沿試管壁加人2 mL Kovac氏試劑。(3) VP試驗(yàn)：取枯草芽孢桿菌的24 h純培養(yǎng)物，用無菌接種環(huán)接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48～72 h。取出后在培養(yǎng)液中先加0.6 mLVP試劑甲液，再加乙液0.2 mL,充分混勻。放在試管架上，靜置15 min后培養(yǎng)液呈紅色者為陽(yáng)性，不變色為陰性。(4)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)：取適量枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養(yǎng)物，用移液槍接種至枸櫞酸鹽生化管中，37 ℃培養(yǎng)48 h。(5)硫化氫試驗(yàn)：用移液槍吸取適量枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養(yǎng)物，接種至硫化氫生化管中，37 ℃培養(yǎng)24 h。(6)過氧化氫酶試驗(yàn)：用接種環(huán)勾取枯草芽孢桿菌的單一菌落，置于干凈的玻片中央，加一滴3%雙氧水于菌落上，立即觀察有無氣泡出現(xiàn)。(7)脲酶試驗(yàn)：用移液槍吸取適量枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養(yǎng)物，接種至尿素生化管中，37 ℃培養(yǎng)24 h。(8)淀粉水解試驗(yàn)：將枯草芽孢桿菌劃線接種于3%可溶性淀粉瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。取出平板，在菌落處滴加少許碘液，觀察滴加碘液處的培養(yǎng)基顏色是否變藍(lán)。(9)硝酸鹽還原試驗(yàn)：用移液槍吸取適量枯草芽孢桿菌的24 h純液體培養(yǎng)物，接種至硝酸鹽(還原)生化管中，37℃培養(yǎng)24 h。再分別滴加3～5滴VP甲液和VP乙液，若30 s內(nèi)出現(xiàn)紅色即為陽(yáng)性。若不變紅，加入少量的鋅渣然后變紅的為陰性。(10)明膠液化試驗(yàn)：取枯草芽孢桿菌的純培養(yǎng)物，用接種針或接種環(huán)穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，22 ℃培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)基的液化狀態(tài)，觀察時(shí)，將其倒置，然后用手指輕輕彈動(dòng)玻管，觀察是否有液體流動(dòng)，有則為陽(yáng)性，無則為陰性。

1.5.3 分子鑒定 (1)提取DNA：按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)(離心柱型)說明書操作。(2)PCR擴(kuò)增：枯草芽孢桿菌的16s rRNA 擴(kuò)增引物采用通用引物，正向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[8]。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×Es Taq MasterMix(Dye)， 25 μL；Forward Primer，10 um，2 μL；Reverse Primer，10 um，2 μL；Template DNA，2 μL；雙蒸水(ddH2O)，19 μL。以提取的DNA為模板，按以上PCR反應(yīng)體系依次加入模板DNA和其他試劑，置于PCR儀中開始擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性，94 ℃，2 min；變性，94 ℃，30 s；退火，55～65 ℃，30 s；延伸，72 ℃，30 s；25～35個(gè)循環(huán)；終延伸，72 ℃，2 min[9]。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。(3)分子檢測(cè)：將以上試驗(yàn)所得的疑似枯草芽孢桿菌送由生工生物工程(武漢)股份有限公司進(jìn)行16s rRNA測(cè)序。(4)16s rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性分析：將所測(cè)得的16s rRNA序列用NCBI中的BLAST網(wǎng)站與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析，運(yùn)用MEGA 4 軟件進(jìn)行序列同源性分析并制作系統(tǒng)發(fā)育樹[10]。

1.6 細(xì)菌的保存

配置50%濃度的甘油，高溫高壓滅菌后，按50%甘油：菌液為1:1的比例充分混合，先置于-20 ℃冰箱24 h，然后置于-80 ℃冰箱保存[11]。

1.7 枯草芽孢桿菌的篩選

1.7.1 牦牛源枯草芽孢桿菌的抑菌試驗(yàn) 對(duì)復(fù)蘇的4株牦牛源枯草芽孢桿菌的12 h培養(yǎng)物進(jìn)行3 500 r/min離心5 min。將指示菌大腸埃希菌(血清型為O111)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)復(fù)蘇，指示菌菌液濃度稀釋至1 cfu/L。分別取已稀釋好的大腸埃希菌(血清型為O111)菌液0.4 mL和金黃色葡萄球菌菌液0.4 mL，用滅菌的三角環(huán)均勻涂布在NA培養(yǎng)基上，用鑷子取出已被滅菌的牛津杯，輕輕放在已涂布過大腸桿菌O111菌液和金黃色葡萄球菌菌液的NA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上放4只牛津杯，注意4只牛津杯的分布位置要均勻。然后將其放入4 ℃冰箱中，30 min后取出。分別吸取0. 25 mL離心后的Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC6，Yak-KC7的上清液，然后分別注入4個(gè)牛津杯中，先將其放入4 ℃冰箱擴(kuò)散24 h，然后接著將其放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，用游標(biāo)卡尺精準(zhǔn)測(cè)量抑菌圈直徑。該試驗(yàn)操作3次，取平均值。

1.7.2 人工腸液耐受性試驗(yàn) 細(xì)菌復(fù)蘇后，離心收集菌體，用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基重懸至108CFU/mL，加入1%的胰蛋白酶，37 ℃培養(yǎng)1 h，10倍倍比稀釋，涂布于選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，采用平板稀釋法計(jì)數(shù)[12]。

1.7.3 豬膽鹽試驗(yàn) 配制含有豬膽鹽溶液的選擇培養(yǎng)基，濃度分別為0.03 g/100 mL，0.10 g/100 mL，0.20 g/100 mL和0.30 g/100 mL。高溫高壓滅菌后，接種枯草芽孢桿菌的純培養(yǎng)物，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算其存活率[13]。

1.7.4 高溫耐受性試驗(yàn) 將枯草芽孢桿菌菌液分別置于85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃水浴鍋30 min，以室溫下未水浴加熱的為對(duì)照組。重復(fù)3次，計(jì)算其存活率[14]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次。所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

由圖1可以看出，培養(yǎng)基菌落形態(tài)為圓形或不規(guī)則，表面粗糙[15]，呈白色至黃色；革蘭氏染色為陽(yáng)性；孔雀石綠染色芽孢呈綠色，菌體呈紅色；芽孢染色液染色菌體呈藍(lán)色，芽孢不著色。

圖1 枯草芽孢桿菌形態(tài)學(xué)鑒定A. 選擇培養(yǎng)基菌落形態(tài);B. 革蘭氏染色(10×100);C. 孔雀石綠水溶液染色(10×100);D. 芽孢染色(10×100)Fig. 1 Morphological identification of Bacillus SubtilisA.colony morphology of selected medium;B. gram staining(10×100);C. staining with malachite green water solution(10×100);D. spore staining(10×100)

2.2 枯草芽孢桿菌的生化鑒定結(jié)果

4株分離株生理生化鑒定結(jié)果見表1。由表1可知，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等生化管與試驗(yàn)菌株反應(yīng)由紫色變?yōu)辄S色，結(jié)果為陽(yáng)性，過氧化氫酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)等結(jié)果均為陽(yáng)性，與趙小琪等[16]的《豬源性芽孢桿菌的篩選與鑒定》結(jié)果一致，初步鑒定4株菌均屬于芽孢桿菌屬。芽孢位于菌體中央或次極端，形狀為橢圓形，淀粉水解、吲哚試驗(yàn)、明膠水解、硝酸鹽還原、產(chǎn)氣、VP試驗(yàn)、菊糖、甘露醇、蕈糖(海藻糖)、水楊苷等試驗(yàn)結(jié)果，均符合《臨床微生物學(xué)手冊(cè)》，初步鑒定為枯草芽孢桿菌[17]。鑒定結(jié)果見表1。

2.3 枯草芽孢桿菌的分子鑒定結(jié)果

由圖2可見，基因組 DNA 瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果，顯示試驗(yàn)菌的PCR條帶在1 500 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致[18]。

西藏牦牛源枯草芽孢桿菌分離株16s rRNA系統(tǒng)進(jìn)化分析見圖3。由圖3可知，10個(gè)序列的進(jìn)化樹的進(jìn)化距離為0.0020，說明各序列之間的同源性較近，包括10個(gè)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示1個(gè)分支。由圖4可知，Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC6，Yak-KC7之間的同源性在98.4%～99.5%，試驗(yàn)菌和數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)菌株的同源性均高于98.1%，且最高達(dá)到99.6%，其中Yak-KC7與標(biāo)準(zhǔn)株枯草芽孢桿菌(GU902972.1)處于較近位置。結(jié)合生理生化結(jié)果，鑒定Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC6，Yak-KC7均為枯草芽孢桿菌。

表1 4株分離株生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification results of 4 isolates

圖2 基因組DNA瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果 Fig. 2 Agarose gel test results of genomic DNA M. DNA Marker DL 2000；1. Yak-KC1，2. Yak-KC5；3. Yak-KC6；4. Yak-KC7

2.4 枯草芽孢桿菌的篩選結(jié)果

2.4.1 抑菌試驗(yàn) 4株牦牛源枯草芽孢桿菌對(duì)大腸埃希氏菌(血清型為O111)和金黃色葡萄球菌都具有抑菌作用，但抑菌效果不同。對(duì)金黃色葡萄球菌，Yak-KC9的抑菌效果最佳，抑菌直徑最大達(dá)到26 mm；其次是Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC7，抑菌直徑分別達(dá)到(16±1)mm，(20±2)mm，(20±1)mm。對(duì)大腸埃希氏菌(血清型為O111)，Yak-KC9的抑菌效果最佳，抑菌直徑達(dá)到(25±1)mm；其次是Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC7，抑菌直徑分別達(dá)到(17±1)mm，(22±2)mm，(20±2)mm。Yak-KC9對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果極顯著高于Yak-KC1(P<0.01)，顯著高于Yak-KC7(P<0.05)，與Yak-KC5差異不顯著。對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌效果，Yak-KC9極顯著高于Yak-KC1(P<0.01)，顯著高于Yak-KC1和Yak-KC5(P<0.05)。

圖4 西藏牦牛源枯草芽孢桿菌分離株(Yak-KC1，Yak-KC5，Yak-KC6，Yak-KC7)16s rRNA同源性分析Fig. 4 Homology analysis of 16s rRNA isolates of yak-derived Bacillus subtilis from Tibet (yak-kc1, yak-kc5, yak-kc6, yak-kc7)

2.4.2 人工腸液耐受性試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，4個(gè)菌株在人工腸液環(huán)境下存活率達(dá)到74.5%以上，均有較好的人工腸液耐受能力(P>0.05)。同比，Yak-KC7的人工腸液耐受性最佳。

表2 4株枯草芽孢桿菌在人工腸液環(huán)境下的存活率Table 2 Survival rate of 4 Bacillus subtilis strains in artificial intestinal fluid environment %

2.4.3 豬膽鹽試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，隨膽鹽濃度上升，4株枯草芽孢桿菌的存活率下降，同比，豬膽鹽試驗(yàn)中Yak-KC7的耐受性最佳。

表3 不同濃度豬膽鹽環(huán)境下枯草芽孢桿菌的存活率Table 3 Survival rate of Bacillus subtilis under different concentrations of pig bile salts[19]

2.4.4 高溫耐受試驗(yàn)結(jié)果 由表4可知，菌株在85 ℃ 條件下存活率明顯高于100 ℃條件下的存活率，并隨著溫度的上升存活率下降明顯[20]，同比，Yak-KC7的高溫耐受性最佳。

表4 不同溫度下枯草芽孢桿菌的存活率Table 4 Survival rate of Bacillus subtilis at different temperatures

3 討 論

枯草芽孢桿菌能調(diào)解腸道菌群平衡，改善動(dòng)物腸道的健康狀況，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，提高動(dòng)物的免疫力，因?yàn)榭莶菅挎邨U菌特有的益生效果，能保護(hù)腸道黏膜組織，所以枯草芽孢桿菌是一種重要的腸道益生菌[21]。

本試驗(yàn)中 ，從形態(tài)學(xué)鑒定及生化試驗(yàn)結(jié)果均符合《臨床微生物學(xué)手冊(cè)》“表26-1芽孢桿菌屬、土壤芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬部分種的鑒別特征”中對(duì)枯草芽孢桿菌的特征鑒定。形狀為橢圓形或稍長(zhǎng)，PCR擴(kuò)增條帶位置在1 500 bp左右，16s rRNA測(cè)序同源性比較結(jié)果高達(dá)99.6%，鑒定為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮益生性的前提是必需具備良好的腸液、膽鹽耐受性；作為飼料中抗生素的優(yōu)良替代益生菌的前提是，在飼料加工過程中接受高溫滅活處理后仍具備活性的能力[22]。本試驗(yàn)設(shè)普通培養(yǎng)基為對(duì)照組，人工腸液、豬膽鹽、高溫處理培養(yǎng)基為試驗(yàn)組。研究結(jié)果表明，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7在人工腸液環(huán)境下的存活率均超過75%；在豬膽鹽環(huán)境中的存活率隨豬膽鹽濃度的上升而下降，存活率范圍在49.8%～85.8%；在高溫環(huán)境下，隨溫度上升菌株存活率明顯下降，85 ℃的存活率顯著高于100 ℃的存活率，范圍在11.3%～90.6%之間。4個(gè)菌株均具有一定的腸液、膽鹽、高溫耐受性，Yak-KC7的耐受性最好。