郭穎 張弘

(昆山市婦幼保健所，江蘇 昆山 215300；2.蘇州大學附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

我國衛(wèi)生部2012年9月發(fā)布的《中國出生缺陷防治報告(2012)》統(tǒng)計中我國出生缺陷發(fā)生率約為5.6%[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織2015年報道，在新生兒死亡原因調(diào)查中，出生缺陷位于前3名的位置，每年大約有27.6萬新生兒因出生缺陷死亡。染色體異常是導致新生兒出生缺陷最多的一類遺傳學疾病。唐氏綜合征(Downs' syndrome，DS)、愛德華綜合征(Edwards’ syndrome，ES)、13-三體綜合征及性染色體的數(shù)目異常是最常見的染色體病，占染色體疾病的80%～95%[2,3]。在早期流產(chǎn)的原因中，胚胎染色體異常占50%～60%[4]，在新生的活嬰中染色體異常的發(fā)生率約為0.5%～1%[5]。生長發(fā)育遲緩、智力低下及伴多結(jié)構(gòu)畸形是染色體疾病的共同特征，且目前尚無有效的治療方法，所以對于降低出生缺陷來說防大于治，世界衛(wèi)生組織倡議有效降低出生缺陷首先要做好產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷工作，好的篩查方法能更好地指導產(chǎn)前診斷及時確診疾病，減少缺陷兒的錯誤出生，但是每種篩查方法并不是完美的檢查，均有各自的缺點及局限性，本研究目的就在于探索一種經(jīng)濟、簡便、安全、準確性高的產(chǎn)前篩查及診斷方案，及早發(fā)現(xiàn)染色體異常胎兒，有效地降低出生缺陷。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年1～12月昆山市婦幼保健所唐氏篩查門診接診的24 986例孕15～20+6周單活胎妊娠孕婦，預產(chǎn)年齡<35周歲，簽署產(chǎn)前篩查知情同意書，根據(jù)篩查結(jié)果接受進一步的遺傳咨詢。按照孕婦血清學篩查結(jié)果分為高風險組A組及低風險組B組；再根據(jù)后續(xù)的檢查方案將A、B兩組進行再分類，即A組分為A1組(血清學篩查高風險直接進行羊水穿刺組)及A2組(血清學篩查高風險先進行無創(chuàng)篩查組)；B組分為B1組(血清學篩查臨界風險進行軟指標篩查組)及B2組(血清學篩查臨界風險進行無創(chuàng)篩查組)。

1.2 研究方法

1.2.1 母體血清學篩查 選擇中孕期血清學篩查二聯(lián)方案，抽取孕婦孕15～20+6周空腹或素食靜脈血 3～5ml，離心后取血清采用浙江省博圣生物技術(shù)股份有限公司時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)，配套試劑檢測甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、β-人類絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-HCG)，檢測步驟嚴格按照標準化操作程序進行，結(jié)合孕婦年齡、孕周、體重、既往妊娠史、有無糖尿病、吸煙等因素，運用Lifecycle3.2 軟件自動計算DS、ES的風險值，高風險切割值為DS：1/270、ES：1/350，另外將單項指標AFP MoM值≤0.4，HCG MoM值≤0.25者納入高風險組。臨界風險均設(shè)定為≥1/1000的低風險。

1.2.2 超聲軟指標篩查 對臨界風險孕婦孕18～20周運用GE VOLUSON E8彩色多普勒超聲診斷儀，二維凸陣探頭，頻率2.5～5.0MHz，進行超聲軟指標篩查，運用的中孕期超聲軟指標有：①頸部皮膚皺褶(nuchal fold，NF)增厚；②鼻骨缺失或短??；③側(cè)腦室增寬；④腸管強回聲；⑤脈絡(luò)叢囊腫；⑥心室強光點；⑦腎盂增寬；⑧小指中節(jié)指骨骨化不全；⑨單臍動脈。對于①②③單項陽性者或其他項2項以上陽性者建議羊水穿刺胎兒染色體檢查，④～⑨單項陽性者建議行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)。

1.2.3 NIPT 孕婦知情同意后，于妊娠12～26+6周抽外周血10ml，基于Illumina平臺的國產(chǎn)化高通量測序儀，即北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司的NextSeq CN500，配備胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)對孕婦外周血中胎兒游離 DNA 進行深度測序，配合特殊的生物信息學分析方法，當胎兒游離DNA占比濃度低于3%時，要求重新采集血樣，在胎兒游離DNA濃度足夠高的情況下，評估胎兒患DS、ES、13-三體綜合征的風險，低風險參考值為-3.0～3.0。

1.2.4 胎兒染色體檢測 對于母體血清學篩查、超聲軟指標篩查或NIPT產(chǎn)前篩查高風險孕婦，在知情同意的情況下行羊水穿刺術(shù)，在孕 20～26周在超聲實時引導下行羊膜囊穿刺術(shù)，根據(jù)高風險情況及孕婦意愿分別采用傳統(tǒng)染色體G顯帶核型分析和染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技術(shù)行染色體核型檢測。①傳統(tǒng)染色體 G 顯帶核型分析：常規(guī)行羊水細胞培養(yǎng)，胰蛋白酶消化法收集細胞并制片，每份標本至少計數(shù) 20 個分裂象，分析 5 個核型，發(fā)現(xiàn)有異常核型時加倍計數(shù)，嵌合體計數(shù)至50個分裂象，制片后Giemsa染色G顯帶，全自動染色體圖像分析儀顯微照相，核型診斷的標準依據(jù)2016年人類細胞遺傳學國際命名體制標準進行染色體 G 顯帶核型分析。②CMA技術(shù)核型分析: 按美國Affymetrix公司生產(chǎn)的Cyto ScanTM750k 芯片的標準操作流程，對孕婦羊水提取的胎兒基因組 DNA 進行酶切、連接、擴增、純化、片段化、標記、芯片雜交、洗滌和掃描以及數(shù)據(jù)分析。

1.3 隨訪 對母體血清學篩查高風險孕婦、軟指標篩查異常孕婦以及所有進行NIPT孕婦進行妊娠結(jié)局隨訪。通過昆山市各產(chǎn)科醫(yī)院、兒童保健門診及唐氏篩查低風險保險理賠等途徑反饋了解漏篩情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SAS9.2軟件進行統(tǒng)計學分析，應用х2檢驗進行分類資料的比較，以P<0.05作為統(tǒng)計學差異水平。

1.5 統(tǒng)計學定義 陽性率=陽性數(shù)/篩查人數(shù)，靈敏度(檢出率)=真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%，假陽性率=假陽性/(真陽性+假陽性)×100%，特異度(真陰性率)=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù))×100%。陽性預測值=真陽性數(shù)/陽性數(shù)×100%。

2. 結(jié)果

2.1 母體血清學篩查檢出效率分析 24 986例孕婦運用孕中期母體血清學二聯(lián)篩查，篩選出高風險組(包括DS風險≥1/270者、ES風險≥1/350者共計1317例，單項值異常(HCG MoM值≤0.25、AFP MoM值≤0.4者)241例；臨界風險組(包括DS風險值在1/271～1/1000之間者、ES風險值1/351～1/1000之間者)共計3123例；低風險人群(DS及ES風險值均<1/1000者)共計20 305例。篩查的陽性率符合“江蘇省產(chǎn)前診斷(篩查)技術(shù)質(zhì)量管理要求”。具體的篩查陽性情況及效率分析見表1、表2。

表1 24 986例孕婦中孕期血清學二聯(lián)篩查結(jié)果

表2 24 986例中孕期母體血清學二聯(lián)篩查效率分析

2.2 血清學篩查高風險A組確診情況 血清學篩查結(jié)果高風險DS高危1254例，ES高危63例，及單項MoM值異常者241例共計1558例，均首先建議羊水穿刺胎兒染色體檢查，并告知羊水穿刺風險及NIPT局限性，經(jīng)孕婦及家屬知情同意后，直接選擇羊水穿刺(A1組)390例，拒絕羊水穿刺選擇NIPT(A2組)1001例，經(jīng)過隨訪拒絕進行下一步檢查或失訪共167例，高風險組包括A1組(血清學篩查高風險直接羊水穿刺組)及A2組(血清學篩查高風險無創(chuàng)篩查組)檢出異常情況具體見下表3，最終經(jīng)過產(chǎn)前診斷確診DS 10例，ES 4例，13-三體綜合征1例，其他染色體異常19例，除目標染色體疾病外的共20例其他染色體的具體情況見表4。在高風險A2組中，由于拒絕羊水穿刺選擇無創(chuàng)篩查，無創(chuàng)篩查結(jié)果低風險中妊娠結(jié)局染色體異常2例，其中ES 1例，6號染色體小片段缺失(arr[hg19]6p12.2(21,816,542-22,431,031)×1)1例。A1組及A2組的染色體異常的靈敏度分別為100%、89%，兩組檢出效率比較，χ2=6.74，P=0.01，差異有統(tǒng)計學意義。其表明了無創(chuàng)篩查的局限性，NIPT低風險不能完全排除染色體異常。

表3 1558例血清學篩查高風險A1及A2組確診情況表

表4 血清學篩查高風險者檢出20例其他染色體異常情況

2.3 血清學篩查臨界風險B組確診情況 當血清學篩查風險值介于高風險與1/1000的風險稱為臨界風險，包括DS風險值≥1/1000且<1/270者及ES風險值≥1/1000且<1/350者。對于臨界風險者，遺傳咨詢門診再次告知血清學篩查存在較高的漏篩率，建議進一步篩查如超聲軟指標篩查和NIPT以降低漏篩可能，并告知NIPT及超聲軟指標篩查的各自檢出率及準確性，孕婦知情后根據(jù)自身經(jīng)濟條件選擇相應檢查。3123例篩查臨界風險者中，743例拒絕行進一步篩查，1479例選擇超聲軟指標篩查，即B1組(血清學篩查臨界風險選擇軟指標篩查組)，901例選擇NIPT，即B2組(血清學篩查臨界風險選擇無創(chuàng)篩查組)，通過進一步篩查后最終通過羊水穿刺確診檢出異常情況如下表5。最終經(jīng)產(chǎn)前診斷確診DS 3例，ES 1例，其他染色體異常4例，其他染色體異常的具體情況見表6。2例臨界風險者經(jīng)超聲軟指標篩查低風險者出生后確診DS。B2方案在靈敏度及特異度上均高于B1方案，差異有統(tǒng)計學意義。

表5 3123例臨界風險者B1及B2組確診進一步篩查檢出異常情況表

表6 血清學篩查臨界風險者檢出其他染色體異常情況表

2.4 血清學篩查低風險漏篩染色體疾病情況分析 4例出生的DS患兒中，其中2例為血清學篩查臨界風險，經(jīng)超聲軟指標再次篩查未見明顯異常。另2例血清學篩查為低風險，故未行超聲軟指標篩查及NIPT，其中一例在行孕20～24周胎兒畸形篩查時發(fā)現(xiàn)軟指標異常，孕婦未引起重視未遵醫(yī)囑進一步產(chǎn)前診斷導致缺陷兒出生。

表7 4例DS患兒情況表

2.5 不同的篩查方案對胎兒染色體異常的檢出效率不同 血清學篩查后，結(jié)果為高風險或低風險，如只對于高風險人群進行處理建議行羊水穿刺術(shù)或先行NIPT，NIPT陽性病例再行羊水穿刺確診，即A方案能檢出目標染色體疾病14例，其他染色體異常20例；如將低風險中≥1/1000者進行再次管理，進一步篩查，即A+B方案，共檢出了目標染色體疾病18例，其他染色體異常25例。A組方案對目標疾病的檢出率為63.6%；A+B組方案，對目標疾病的檢出率達81.8%。兩種方案檢出率比較，χ2=11.76，P<0.001，差異有統(tǒng)計學意義。由此看來，將部分低風險患者進行管理，將進一步提高疾病檢出率。兩種方案的篩查結(jié)果分析見表8。

表8 血清學篩查高風險組及高風險+臨界風險聯(lián)合篩查對目標疾病*檢出情況表

2.6 不同篩查方案衛(wèi)生經(jīng)濟學方面的評價 在本市，孕中期血清學篩查40元/例(昆山政府減免70元)，行羊水穿刺染色體核型分析每例費用約1200元，CMA費用每例3600元，NIPT檢測費用每例2210元，超聲軟指標篩查費用每次170元。根據(jù)各方案篩查的效率計算，每檢出1例患兒的費用=總費用(血清學篩查例數(shù)×40+羊水穿刺例數(shù)×1200+CMA例數(shù)×3600+NIPT例數(shù)×2210+軟指標篩查例數(shù)×170)/檢出目標疾病數(shù)。另外，對于NIPT陽性行羊水穿刺者，費用最高可報銷2500元，例如A2組應扣除的費用為1200×20+2500×4=34 000元，B1組羊水穿刺12人中有2例是NIPT陽性病例，故B1組總費用中應扣除2500×2=5000元；B2組總費用中扣除13×1200+2×2500=20 600元。具體見表9。從圖1顯示的費用高低顯示，每例染色體異?；純旱臋z查費用，A2組略低于A1組，B1組明顯低于B2組。所以，僅從衛(wèi)生經(jīng)濟學評價方面來看，當血清學篩查結(jié)果為高風險時優(yōu)選NIPT再次深度篩查，篩查陽性病例再進一步確診。當血清學篩查結(jié)果為臨界風險時優(yōu)選超聲軟指標篩查，根據(jù)超聲軟指標陽性結(jié)果分別指導再次無創(chuàng)深度篩查或直接進行產(chǎn)前診斷。

表9 不同篩查組別的衛(wèi)生經(jīng)濟學評價

圖1 不同篩查組別的衛(wèi)生經(jīng)濟學評價

3 討論

3.1 產(chǎn)前篩查系產(chǎn)前診斷前的必備檢查 目前，針對胎兒染色體異常的產(chǎn)前診斷技術(shù)均為侵入性有創(chuàng)檢查，存在流產(chǎn)、出血、感染，甚至羊水栓塞等并發(fā)癥。這些并發(fā)癥的發(fā)生率雖然都不高，但還是成為了孕婦及家屬難以克服的心理障礙。當然也沒有必要為了達到100%的檢出率讓所有的孕婦都進行產(chǎn)前診斷檢查，這樣會帶來很多不必要的流產(chǎn)事件，同時，讓所有的孕婦直接選擇產(chǎn)前診斷也是目前的醫(yī)療資源所不能滿足的。只有先進行產(chǎn)前篩查，根據(jù)篩查結(jié)果針對性的指導，才能讓產(chǎn)前診斷技術(shù)很好的有的放矢。

在美國，在孕期行唐氏篩查的檢查率達63.0%，法國是65.0%[6]。而在我國，產(chǎn)前篩查被要求作為產(chǎn)前檢查的常規(guī)檢查，檢查率要求達到90%以上。國內(nèi)有研究顯示，在沒有開展產(chǎn)前篩查及診斷的地區(qū)，唐氏患兒活產(chǎn)兒中的發(fā)病率>1/785，而在產(chǎn)前篩查和診斷開展的地區(qū)活產(chǎn)兒中的唐氏患兒的發(fā)生率為 1/1500～1/1750[7]。在本研究中，聯(lián)合了血清學篩查、超聲篩查及NIPT技術(shù)，該年度4例唐氏患兒漏篩出生，在活產(chǎn)兒中的發(fā)病率僅為1/6227，是明顯下降的。

另外，篩查的目標疾病占所有檢出染色體異常的41.9%，說明血清學篩查高風險者不僅能發(fā)現(xiàn)目標疾病，對其他染色體異常也有一定的提示，這與國內(nèi)的一些研究相符[8，9]。

3.2 聯(lián)合篩查方案優(yōu)于單一篩查方案 由于孕中期的母體血清學二聯(lián)篩查方法存在著檢出率不高、假陽性率高的缺點，迫使產(chǎn)前篩查技術(shù)不斷的發(fā)展。國際上有3項著名的前瞻性研究：SURUSS、BUN和FASTER，找到了對DS 檢出率最高的篩查方案是早孕期用血清學方法與超聲方法的聯(lián)合篩查方案和聯(lián)合序貫篩查方案，對DS 的檢出率可提高到90%～97%[10-12]。本研究顯示，僅對血清學篩查高風險人群進行產(chǎn)前診斷，對于目標疾病(DS及ES)的檢出率是63.6%，當繼續(xù)對血清學篩查臨界風險者聯(lián)合超聲軟指標篩查或NIPT后，能將目標疾病的檢出率提升至81.8%，χ2=11.76，P<0.001，差異有統(tǒng)計學意義。同時，還能再發(fā)現(xiàn)更多致病性的其他染色體異常。所以，聯(lián)合篩查已成為產(chǎn)篩的必然趨勢。

3.3 NIPT是最敏感的篩查技術(shù) 從1997年Lo等[13]通過聚合酶聯(lián)反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增技術(shù)發(fā)現(xiàn)在母體血漿和血清中存在胎兒游離DNA，到2008年Chiu等首次報道了用大規(guī)模平行測序技術(shù)平臺來檢測胎兒非整倍體，在20年時間里，NIPT技術(shù)發(fā)展得很迅猛。在本研究中，近70%的血清學篩查高風險人群拒絕羊水穿刺選擇NIPT。有研究顯示，自 2012 年以來，由于 NIPT 應用減少了40%～76%的介入性診斷[14]。為了盡可能地降低假陽性率，是否可以將NIPT作為胎兒染色體異常的一線篩查方案成為了社會關(guān)注的熱點。不僅如此，目前國際上許多學術(shù)組織認為高風險人群可接受 NIPT[15，16]。但是，NIPT技術(shù)的開展應在國家行業(yè)技術(shù)規(guī)范的指導下進行，高風險人群仍屬于NIPT檢測的慎用人群。在本研究中，血清學篩查高風險后選擇NIPT，陽性者再進行產(chǎn)前診斷取得了最優(yōu)的衛(wèi)生經(jīng)濟學評價，選用該方案檢出每例染色體異常所需的花費最低。

3.4 NIPT技術(shù)的局限性 雖然NIPT 是目前對于常染色體非整倍體篩查最敏感的篩查技術(shù)，但仍然存在假陰性率及假陽性率(盡管非常低)，所以，NIPT不能代替產(chǎn)前診斷作為最終的診斷結(jié)果[17]。對于篩查局限性的原因，Wang等[18]認為，母血漿中胎兒游離DNA所占的比例較低，且其來源于胎盤組織，如果出現(xiàn)限制性胎盤嵌合體或是母親本身染色體重排，或胎盤本身出現(xiàn)老化、發(fā)育不良或者破損導致胎盤屏障功能障礙時會導致胎兒游離DNA含量異常而影響檢測結(jié)果。所以，孕婦本身如肥胖或自身存在血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、免疫治療等會影響結(jié)果的準確性[19-21]，以及由于多胎或多胎中有胚胎停育等情況，均可影響檢測結(jié)果[22]。本研究中，比較A1、A2組的篩查效率有差異，NIPT低風險人群中漏診1例ES及1例6號染色體小片段缺失，所以也進一步證實了NIPT不能作為最終診斷代替羊水穿刺，忽視高風險的漏診將帶來更嚴重的問題。

3.5 血清學聯(lián)合超聲軟指標篩查能獲得更高的衛(wèi)生經(jīng)濟學評價 胎兒超聲軟指標的篩查費用僅為NIPT的十分之一不到，被更多的孕婦所接受，且其除了對胎兒非整倍體有一定的篩查能力，對于胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常也有一定的篩查能力。在本研究中，從臨界風險中檢出的胎兒非整倍體異常75%是通過超聲軟指標篩出后進一步確診，通過超聲篩查檢出的3例染色體異常為致病性疾病，以引產(chǎn)告終。NIPT檢測的2例假陰性病例，在超聲方面也表現(xiàn)出了異常。另外，在進行軟指標篩查時還發(fā)現(xiàn)了10余例胎兒結(jié)構(gòu)畸形，由于存在嚴重的結(jié)構(gòu)畸形，孕婦未進行羊水穿刺胎兒染色體檢查，直接終止了妊娠，因未確診是否存在染色體異常，本研究并未納入研究討論，但也在防控出生缺陷方面尤其是篩查胎兒結(jié)構(gòu)畸形方面做出了一定的貢獻。

在4例出生的DS患兒中，回顧調(diào)查其病史資料，發(fā)現(xiàn)其中2例在超聲篩查時提示陽性結(jié)果，但均未得到孕婦及醫(yī)生的重視，患兒未能在產(chǎn)前診斷。另外2例出生的DS患兒軟指標篩查無異常，顯示了NIPT在對DS篩查的特異性上明顯高于軟指標篩查。

在分析不同篩查組別的衛(wèi)生經(jīng)濟學評價中發(fā)現(xiàn)，對于臨界風險者的后續(xù)篩查方案，先選擇軟指標篩查獲得了更好的性價比。由于我國尚處于地域經(jīng)濟發(fā)展不平衡的時期，所以，在經(jīng)濟發(fā)達的地區(qū)，NIPT應作為血清學篩查臨界風險者的首選，從而獲得更有效的檢出率。在經(jīng)濟落后地區(qū)，選擇NIPT受限制時應積極的推廣超聲軟指標篩查作為補充。