李行友 周媚

重慶海默尼制藥有限公司 重慶北碚 400700

維生素D3粉進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20080096[6]中現(xiàn)只有含量測定方法，目前尚無測定維生素D3粉中有關(guān)物質(zhì)的報(bào)道，根據(jù)現(xiàn)在的法規(guī)要求，為了加強(qiáng)對原料藥維生素D3粉的質(zhì)量控制，需要建立起其有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，對維生素D3粉進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的研究。

維生素D3粉是類白色至淡黃色的易流動(dòng)的顆粒，為維生素D3和生育酚等的混合粉，每克維生素D3粉含維生素D3為2.5mg（即2.5mg /g）（100，000-110，000單位）。該維生素D3加入了大豆油、明膠等輔料制成包合物的形式，提高了穩(wěn)定性。但包合物的形式對維生素D3的提取、以及其有關(guān)物質(zhì)的提取難度增大，同時(shí)由于相關(guān)輔料的存在，對有關(guān)物質(zhì)的分離造成干擾。

我司對比了《中國藥典》2015年版[1]、EP藥典[2]、BP藥典[4]、USP藥典[6]、JP藥典[7]及進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20080096[8]等標(biāo)準(zhǔn)，其中純維生素D3的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中包含有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)。但只有BP藥典[3]、EP藥典[5]（注：EP藥典與BP藥典維生素D3粉項(xiàng)下內(nèi)容完全相同）和進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20080096[8]中有維生素D3粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其余各國藥典均是純維生素D3，而所有維生素D3粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中現(xiàn)都無有關(guān)物質(zhì)檢測項(xiàng)目和檢測方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters e2695+2489）；分析天平（賽多利斯BSA224S、BT25S）；維生素D3對照品（批號：100061-201809），含量：99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；維生素D3粉（10萬單位/克，瑞士DSM Nutritional Products Ltd）；有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)A（Trans-Vitamin D3，反式維生素D3，批號8-ATH-68-1）、雜質(zhì)B（（3β）-7-Dehydro Cholesterol，Provitamin D3，前體維生素D3，批號：10-GHZ-137-1）、雜質(zhì)C（Lumisterol，光甾醇D3，批號：15-UPA-103-1）、雜質(zhì)D（Iso-tachysterol，異速甾醇D3，批號：13-MGG-168-1）、雜質(zhì)E（Tachysterol，速甾醇D3，批號：14-YKZ-119-1）均來至于Toronto Research Chemicals Inc（多倫多研究化學(xué)品公司）。正己烷、正戊醇、異丙醇和異辛烷為色譜純；氨水、雙氧水等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

正相色譜柱（A gilent Z O R B A X R X-SIL（5μm，4.6×250mm），以正已烷-正戊醇（99.7：0.3）為流動(dòng)相，流速為每分鐘2.0mL，檢測波長為265nm。進(jìn)樣體積：20μL。運(yùn)行時(shí)間：維生素D3主峰保留時(shí)間的2倍。

2.2 專屬性

2.2.1 已知雜質(zhì)定位確定

精密稱取相應(yīng)的維生素D3對照品，雜質(zhì)A（反式維生素D3）對照品、雜質(zhì)B（前體維生素D3）對照品、雜質(zhì)C（光甾醇D3）對照品、雜質(zhì)D（異速甾醇D3）對照品、雜質(zhì)E（速甾醇D3）對照品、前維生素D3對照品適量，除維生素D3對照品外，其它雜質(zhì)用少量的三氯甲烷約1ml左右溶解后，再用異辛烷稀釋，配制成混合溶液，精密量取該混合溶液20μL注入液相色譜儀。理論板數(shù)按維生素D3峰計(jì)應(yīng)不低于1500。前維生素D3峰（與維生素D3相對保留時(shí)間約為0.5），反式維生素D3峰（與維生素D3相對保留時(shí)間約為0.6），維生素D3峰與速甾醇維生素D3峰（與維生素D3相對保留時(shí)間約為1.1）之間的分離度均應(yīng)大于1.5.

分別對已知雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E的出峰順序及時(shí)間進(jìn)行確定。確定每個(gè)已知雜質(zhì)的位置如圖1，各雜質(zhì)能完全分離。分離度結(jié)果見表1：

表1 維生素D3 有關(guān)物質(zhì)分離度結(jié)果數(shù)據(jù)

圖1 維生素D3 有關(guān)物質(zhì)色譜圖

2.2.2 空白輔料

按照處方比例取本品空白輔料（生育酚、大豆油、明膠等），維生素D3粉樣品4.0g，照“2.3”項(xiàng)測定方法，制得空白輔料溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖?？瞻纵o料色譜圖如圖2，空白輔料基本無干擾。維生素D3粉樣品色譜圖如圖3。

圖2 空白輔料色譜圖

圖3 維生素D3 粉有關(guān)物質(zhì)色譜圖

2.2.3 破壞性試驗(yàn)

維生素D3粉樣品經(jīng)酸（1mol /L 鹽酸溶液，2.5h）、堿（1mol /L 氫氧化鈉溶液，2.5h）、光照（4500lx，20d）、氧化（30%雙氧水溶液，5h）、高溫（90℃，1h）等進(jìn)行破壞，然后按“2.3”項(xiàng)測定方法配制破壞性溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，經(jīng)高溫、光照破壞后，維生素D3粉含量降幅程度大，酸、堿、氧化等破壞含量降幅不大。但所有破壞實(shí)驗(yàn)均會(huì)使樣品有關(guān)物質(zhì)個(gè)數(shù)增多，雜質(zhì)總量增加。本研究建立的正相色譜條件能使樣品中的主成分、主要有關(guān)物質(zhì)和相鄰雜質(zhì)有效分離，光照破壞維生素D3粉樣品色譜圖如圖4。

圖4 光照破壞維生素D3 粉樣品色譜圖

2.3 測定方法

避光操作，稱取維生素D3粉4.0g，置250mL具塞量筒中，加入60mL的0.3%氨水在50℃的水浴中，手動(dòng)振搖5分鐘，取出，加入100mL異丙醇手動(dòng)振搖2分鐘，再加入50mL異辛烷在振蕩器中，以振動(dòng)頻率200次/分鐘振搖30分鐘，再手動(dòng)振搖2分鐘，靜止分層后，加水30mL，搖勻，取上清液至圓底燒瓶中；再用異辛烷提取4次（50mL/次），合并所有異辛烷在40℃下旋蒸至干，用異辛烷洗滌，并定量至10mL，搖勻，即得供試品溶液（1.0mg VD3/mL）。

對照品溶液（1.0μg VD3/mL）：取供試品溶液1.0mL用異辛烷稀釋至20.0mL。再取1.0mL用異辛烷稀釋至50mL。

系統(tǒng)適用性溶液：取維生D3對照品12.5mg，用正已烷溶解，并稀釋至100mL，取5ml置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加熱1小時(shí)，取出，迅速冷卻，加正已烷5ml，搖勻，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8w主波長分別為254nm和365nm的紫外下照射5分鐘，使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3、維生素D3、和速甾醇D3.按2.1的色譜條件操作。理論板數(shù)按維生素D3峰計(jì)算不低于1500，前維生素D3與雜質(zhì)A（反式維生素D3）之間的不得低于1.5.均符合規(guī)定。

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

取維生素D3對照品適量，精密稱定，用異辛烷配制成0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.30μg/mL、0.50μg/mL、0.75μg/mL、1.0μg/mL（100%測試濃度）、1.25μg/mL、1.5μg/mL的溶液，精密量取20μL分別注入高效液相色譜儀，在2.1的色譜條件下，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別取維生素D3粉4.0g6份，照“2.3”項(xiàng)測定法，分別制得6份供試品溶液，同時(shí)制得6份對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按2.1的色譜條件操作，連續(xù)進(jìn)6針，對照品溶液中維生素D3峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%.結(jié)果表明方法精密度較好。

2.6 中間精密度試驗(yàn)

另一操作人員，照“2.5”項(xiàng)重復(fù)操作測定。對照品溶液中維生素D3峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%.以上兩次精密度測試的12份結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對照品溶液中維生素D3峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%.結(jié)果表明方法中間精密度良好。

2.7 檢測限與定量限

取維生素D3對照品適量，精密稱定，用異辛烷溶解，定量稀釋制成一系列濃度的溶液，取上述溶液20μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，維生素D3的檢測濃度為0.024μg /mL（S /N=3），定量濃度為0.079μg /mL（S/N=10）。

2.8 溶液穩(wěn)定性

取維生素D3粉樣品溶液，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣20μL進(jìn)行測試，結(jié)果表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn)

取約相當(dāng)于維生素D3粉4.0g的空白輔料，9份，精密稱定，分別至250mL具塞量筒中，分別加入50%、100%、150%的維生素D3對照品各3份，照“2.3”項(xiàng)測定法，制得供試品溶液，精密取20μL進(jìn)樣檢測，按2.1的色譜條件操作，按外標(biāo)法計(jì)算，計(jì)算維生素D3的回收率。50%（n=3）、100%（n=3）、150%（n=3）水平的平均回收率分別為96.95%、92.22%、96.10%，RSD%（n=9）為2.6%，結(jié)果表明上述HPLC法測定維生素D3粉中維生素D3有關(guān)物質(zhì)準(zhǔn)確度高。

2.1 0 耐用性試驗(yàn)

調(diào)整流動(dòng)相比例：將正戊烷：正戊醇（99.7：0.3）調(diào)整為（99.5：0.5），采用同一對照品及供試品溶液，以測定維生素D3粉的有關(guān)物質(zhì)A（反式維生素D3）為考察指標(biāo)，所測得的有關(guān)物質(zhì)A（反式維生素D3）RSD（n=8）為4.4%，說明此色譜系統(tǒng)和提取方法用于維生素D3粉中有關(guān)物質(zhì)測定耐用性較好。

2.1 1 樣品測定

使用已建立和驗(yàn)證的方法對DSM公司生產(chǎn)的維生素D3粉原料藥有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果見表2。

表2 DSM 公司3 批維生素D3 粉有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)

依據(jù)《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[9]等進(jìn)行判定，DSM公司生產(chǎn)的維生素D3粉原料藥，3批樣品中有2批雜質(zhì)A（反式維生素D3）是低于報(bào)告限0.05%（日用量≤2g）的；有1批次高于報(bào)告限，但低于各國藥典維生素D3品種項(xiàng)下對該特定雜質(zhì)的最嚴(yán)限度（0.1%）（中國藥典限度為0.5%）。證明該產(chǎn)品中雜質(zhì)A（反式維生素D3）含量符合各國藥典的規(guī)定。

另外，3批樣品檢驗(yàn)結(jié)果均顯示雜質(zhì)B（前體維生素D3）、雜質(zhì)C（光甾醇D3）、雜質(zhì)D（異速甾醇D3）未檢出。而3批樣品中的雜質(zhì)E（速甾醇 D3）均低于報(bào)告限0.05%（日用量≤2g）的。證明該產(chǎn)品中雜質(zhì)E（速甾醇D3）含量符合各國藥典的規(guī)定。

有關(guān)物質(zhì)總量：各國藥典維生素D3品種項(xiàng)下的限度是1.0%，3批樣品的檢測遠(yuǎn)低于這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

以上表明，所建立的分析方法能準(zhǔn)確檢驗(yàn)維生素D3粉中各有關(guān)物質(zhì)的含量。

3 結(jié)語

由于該維生素D3粉加入了大豆油、明膠等輔料制成了包合物的形式，提取測定時(shí)為保證維生素D3及其有關(guān)物質(zhì)提取完全，同時(shí)保證對維生素D3及有關(guān)物質(zhì)不產(chǎn)生破壞，除避光和控制溫度，本文采用了以0.3%氨水為溶解介質(zhì)，使用異辛烷萃取，維生素D3穩(wěn)定，保持完好，回收率高，其它輔料雜質(zhì)較少，提高了維生素D3有關(guān)物質(zhì)的準(zhǔn)確度，操作較簡單。同時(shí)由于每克維生素D3粉僅含維生素D3為2.5mg，使用的樣品量較大（為4.0g左右），采用了提取、旋蒸濃縮過程，保證能使用HPLC-UV上進(jìn)行檢測控制其有關(guān)物質(zhì)，同時(shí)利用獲得的維生素D3已知有關(guān)物質(zhì)，利用相對保留時(shí)間輔以定位，不需要質(zhì)譜（MS）即可準(zhǔn)確檢測其維生素D3有關(guān)物質(zhì)?？捎糜诰S生素D3粉中有關(guān)物質(zhì)的測定。