王小敏，許婳婳，詹若挺，馬新業(yè)*

? 藥材與資源 ?

基于轉(zhuǎn)錄組測序的越南安息香根、莖和葉基因表達分析

王小敏1，許婳婳2，詹若挺1，馬新業(yè)1*

1. 廣州中醫(yī)藥大學 中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，國家中成藥工程技術(shù)研究中心 南藥研發(fā)實驗室，廣東 廣州 510006 2. 廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006

對越南安息香進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得其根、莖和葉的轉(zhuǎn)錄組信息特征。以越南安息香的根、莖和葉作為研究對象，使用Illumina HiSeqTM2000進行越南安息香根、莖和葉的轉(zhuǎn)錄組測序分析。轉(zhuǎn)錄組測序根、莖和葉共獲得53 835 045條高質(zhì)量序列（clean reads）,Trinity de novo組裝獲得69 151條Unigenes，平均長度778.51 nt。BLAST分析表明分別有41 412（59.89%）、31 189（45.10%）、25 539（36.93%）、16 749（24.22%）個Unigenes在Nr、Swiss-port、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫中得到注釋，可歸入GO分類的細胞組分、生物過程和分子功能3大類46分支，涉及129條KEGG標準代謝通路，其中有31個次生代謝標準通路。蛋白編碼框序列3 461個，涉及高等植物轉(zhuǎn)錄因子54個家族。使用MISA軟件挖掘10 974個簡單重復序列（SSRs），二堿基重復SSRs數(shù)量最為豐富，有6282個（57.24%），五堿基重復SSRs最少，占2.45%。利用高通量技術(shù)和生物信息分析獲得了越南安息香根、莖和葉的轉(zhuǎn)錄組信息特征，為后期越南安息香基因功能鑒定、次生代謝途徑解析及調(diào)控機制的研究奠定基礎(chǔ)。

越南安息香；轉(zhuǎn)錄組；功能基因；代謝通路；簡單重復序列

越南安息香(Pierre) Crail ex Har-tw.為安息香科（Styracaceae）安息香屬落葉喬木，又名越南安息香、白背安息香和滇桂野茉莉，俗稱“東京野茉莉”，廣泛分布于我國嶺南地區(qū)，老撾、緬甸等國也有分布；其莖皮受到傷害后的分泌物干燥后作為安息香[1]，始載于《新修本草》，味辛、苦，平，無毒；主心腹惡氣鬼疰。安息香的現(xiàn)代藥理學認為安息香具有抗細菌[2]、抗真菌[3]、抗補體[4]、抗氧化[5]、抗白血病[6]、抗腫瘤[7]等藥理活性?，F(xiàn)代中藥學揭示安息香含有香脂酸類成分，包括苯甲酸、松柏樹乙醚、香草醛、苯甲酸芐脂、2-丙炔酮[8]，此外，安息香含有三萜類成分，包含蘇門答刺樹脂酸、泰安息香樹脂酸、齊墩果酸[6]，可為藥物研發(fā)提供豐富的化合物前體。因此，安息香的資源開發(fā)和基礎(chǔ)研究具有重要的價值和前景。

轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ跊]有基因組的物種來說，可以有效地表征和鑒定植物中次生代謝物質(zhì)的生物合成相關(guān)途徑，揭示植物體的生長發(fā)育、生理適應性以及探索其中的基因序列和表達水平[9-11]。近年來，Illumina測序技術(shù)已廣泛應用于研究植物基因組，并且也應用在番茄[12]、人參[13]、扁豆[14]等物種中，為其種植資源和基因遺傳打下基礎(chǔ)。本研究選擇越南安息香幼苗的根、莖和葉作為基礎(chǔ)材料，使用Illumina HiSeq-2000采集RNA-seq讀數(shù)，以期挖掘安息香根、莖和葉的整體基因表達特征，為該植物基因功能研究、次生代謝途徑解析和調(diào)控探究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 RNA提取與測序

植物材料于2015年10月采自廣州中醫(yī)藥大學，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學馬新業(yè)副研究員鑒定為越南安息香(Pierre) Crail ex Har-tw.。取單株植物根、莖、葉液氮冷凍后迅速存于?80 ℃冰箱至使用。

越南安息香幼苗根、莖和葉的總RNA分離后，用含有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，加入fragmentation buffer使mRNA成為短片段，合成cDNA第1條鏈使用的是六堿基隨機引物（random hexamers），使用添加EB緩沖液的QiaQuick PCR試劑盒純化并洗脫，經(jīng)末端修復、加測序接頭、加poly(A)，大小片段的回收使用瓊脂糖凝膠電泳，最后通過PCR擴增完成cDNA文庫制備，由廣州基迪奧生物科技有限公司（廣州）使用Illumina HiSeqTM2000進行測序。

1.2 序列的從頭組裝和功能注釋

采用FastQC軟件（http://www. bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc/）評估原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量，NGS QC Toolkit（v2.3.3）軟件舍棄低質(zhì)量讀取（http://59.163.192.90:8080/ngsqctoolkit/）。使用Trinitysoftware[11]對RNA-Seq從頭組裝獲得Unigene，其總體表達量使用RPKM法[15]計算。

為了注釋轉(zhuǎn)錄組，利用BLAST將Unigenes比對到蛋白數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-prot、蛋白相鄰類的聚簇（KOG）和京都基因與基因百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）（值＜1×10?5），獲得與相應Unigenes具有最高相似性的蛋白，從而得到相應的注釋，使用Blast2GO軟件對Unigenes進行GO（gene ontology）分類, 用WEGO軟件對獲得的Unigenes進行GO分類，宏觀上認識該物種基因功能的分布情況。

1.3 蛋白編碼框（sequence coding for aminoacids in protein，CDS）及轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

按照Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG優(yōu)先順序把Unigenes序列和以上數(shù)據(jù)庫進行BLASTx比對（＜1×10?5），并確定該Unigene編碼區(qū)的核苷酸序列（序列方向5’至3’端）及氨基酸序列。使用ESTScan預測與以上數(shù)據(jù)庫對比不上的Unigenes的編碼區(qū)和序列方向。將預測到的Unigenes編碼蛋白序列和植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫plantTFDB進行hmmscan比對，獲得轉(zhuǎn)錄因子家族和相關(guān)成員。

1.4 簡單重復序列（simple sequence repeats，SSRs）特征檢測

MISA軟件被用到越南安息香轉(zhuǎn)錄組Unigenes的檢測，搜索SSRs同時進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組組裝和質(zhì)量評估

通過Illumina HiSeqTM2000測序，越南安息香的根、莖和葉分別獲得65 475 824、66 555 768、56 770 948條raw reads，濾過后獲得64 267 196（98.15%）、65 122 652（97.85%）、55 714 504（98.14%）條clean reads，分別包含濾過后核苷酸8 033 399 500、8 140 331 500和6 964 313 000個。Q20（堿基量≥20%）均大于98%和Q30（堿基量≥30%）均＞96%，說明測序數(shù)據(jù)控制良好，clean reads質(zhì)量合格。Trinity組裝得到69 151條Unigenes，平均長度778.51 nt，最長達10 486 nt，最短為201 nt，N50等于1333。

2.2 Unigenes功能注釋

用BLAST將所獲得的Unigenes比對到Nr、Swiss-port、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫，并統(tǒng)計所注釋到的Unigenes數(shù)目和功能信息。結(jié)果顯示，41 412（59.89%）條Unigenes在Nr數(shù)據(jù)庫得到注釋，在Swiss-prot、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫分別注釋了31 189（74.3%）、25 539（60.9%）、16 749（39.9%）條Unigenes。成功注釋的Unigenes共41 951條，占66.67%，27 200（39.33%）條未得到注釋。Unigenes長度分布見圖1-A，17 387條Unigenes長度大于等于1000 nt，5674條Unigenes超過2000 nt。圖1-B展示的是reads在Unigene上的覆蓋度，reads在11～100的Unigenes數(shù)量最多，有27 240條；其次是reads在1～10的Unigenes，有5150條；reads在101～200、2001～4000、1001～2000、＞10 000的數(shù)量分別是4669、4226、3935和3186條；其他reads在Unigenes上的覆蓋度均相對較小。

以注釋到Nr數(shù)據(jù)庫的Unigenes為例，同源物種如圖2，在匹配度最高的物種中，葡萄L.占的比率為最高，達4160（10.05%）條；其次為歐洲油菜L. 1889（4.56%），黃豆(Linn.) Merr. 1630（3.94%），毛果楊L. 1615（3.90%），蒺藜苜蓿L. 1614（3.90%），擬南芥L. 1577（3.81%），粳稻Japonica Group 1563（3.77%），可可樹L. 1537（3.71%），番茄L. 1400（3.38%），蘋果B. 1262（3.05%）；匹配度在3.04%～1.46%的有13 304條，小于1.46%匹配度的有9 861條，占23.81%。根據(jù)Nr進一步獲得GO分類信息，如圖3，148 884條Unigenes被注釋到細胞組分、生物過程和分子功能3個GO類別的46個小組。生物過程中代謝過程（metabolic process）、細胞過程（cell process）和多細胞生物過程（multicellular organismal process）豐度最高，分別為15 930、14 748和11 806 條；生物調(diào)節(jié)（biological regulation）和應激適應（response to stimulus）分別有5087和4630條。分子功能中催化活性（catalytic activity）和結(jié)合功能（binding）的基因最多，分別達15 160和14 029條，其他基因表達量都較少。細胞組分中細胞（cell）及細胞組分（cell part）較高，分別達10 915和10 914條；細胞器（organelle）、細胞膜（membrane）分別有8509和5938條；細胞膜組分（membrane part）、器官組分（organelle part）和大分子復合物（macromolecular complex）分別有4125、3713和2712條，其他基因均較小。

圖1 Unigenes的長度分布(A) 和reads的覆蓋范圍(B)

圖2 Unigenes在Nr數(shù)據(jù)庫中的物種匹配

圖3 轉(zhuǎn)錄組Unigenes的GO分布

為了進一步分析越南安息香的轉(zhuǎn)錄組Unigenes的功能，使用KOG功能分類分析（圖4），一共獲得25種KOG分類，種類較全面，其中，一般功能預測的基因（general function prediction only）達8 025條，為最多；信號轉(zhuǎn)導機制類（signal transduction mechanisms）、翻譯后修飾、蛋白反轉(zhuǎn)和伴侶（posttranslational modification, protein turnover, chaperones）次之，分別有5082和4862條；其他分類基因豐度參差不齊。

越南安息香根、莖和葉的轉(zhuǎn)錄組Unigenes參與KEGG代謝通路被分為5類：代謝（metabolism）8878條、遺傳信息處理（genetic information processing）3 936條、細胞過程（cellular processes）753條、有機系統(tǒng)（organismal systems）573條和環(huán)境信息處理（environmental information processing）548條。其中，7533條Unigenes被歸類于94個標準代謝通路，根據(jù)注釋量選擇前9個代謝通路展示見表1，這些通路含有的Unigenes數(shù)量均不低于200條。

圖4 轉(zhuǎn)錄組Unigenes的KOG分布

表1 轉(zhuǎn)錄組Unigenes的KEGG通路統(tǒng)計分析

進一步分析KEGG發(fā)現(xiàn)，940條Unigenes參與苯丙烷類、類黃酮類、萜類等20個次生代謝標準生物合成通路（表2）。其中，苯丙烷類生物合成（ko00940）注釋到的基因數(shù)最多，達276條；其次是類黃酮的生物合成（ko00941），基因數(shù)為100條；萜類化合物骨架生物合成（ko00900）有關(guān)基因93條；80條基因與芪類化合物、二芳基庚烷和姜辣素（ko00945）有關(guān)；分別有64、46、45和41條基因與類胡蘿卜素生物合成（ko00906）、異喹啉生物堿生物合成（ko00950）、二萜類生物合成（ko00904）和莨菪烷類、哌啶和哌啶生物堿生物合成（ko00960）有關(guān)；37條參與玉米素的生物合成（ko00908）；油菜素類固醇的生物合成（ko00905）有35條；34條基因涉及倍半萜和三萜類的生物合成（ko00909）；花青素、單環(huán)內(nèi)酰胺類、檸檬烯和蒎烯的降解、單萜類生物合成、黃酮和黃酮醇類合成、異黃酮類合成、芥子油苷的生物合成、咖啡因的合成和甜菜紅色素的生物合成相關(guān)的基因均較少，在30條以下。這些數(shù)據(jù)為越南安息香次生代謝機制研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

2.3 CDS和轉(zhuǎn)錄因子分析

對越南安息香所有Unigenes進行CDS分析，通過BLAST獲得41 351個CDS序列，利用ESTscan數(shù)據(jù)庫得到3461條CDS。轉(zhuǎn)錄因子通過預測，被分到54個轉(zhuǎn)錄因子家族，其中C2H2、ERF、bHLH、MYB、GRAS、NAC、MYB-relate和WRKY占主體，說明眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程（圖5）參與了越南安息香根、莖和葉的生理代謝。

表2 轉(zhuǎn)錄組Unigenes次生代謝的KEGG通路注釋統(tǒng)計

圖5 轉(zhuǎn)錄因子分析

2.4 SSRs特征分析

MISA軟件用于Unigenes的SSRs檢索，8712個Unigenes中有10 974個SSRs（表3）。二堿基重復SSRs豐度最高，為6282（57.24%）個，其中，AG/CT類型所占比例最高；其次是三堿基重復，3072（27.99%）個；四、五和六堿基分別有777（7.08%）、269（2.45%）和574（5.23%）個。

表3 轉(zhuǎn)錄組Unigenes SSRs分布

3 討論

高通量測序技術(shù)在藥用植物的研究上已經(jīng)展開了較為廣泛的應用，并取得了重大的進展[16]。該研究首次對越南安息香采用Illumina HiSeqTM2000技術(shù)獲得其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并進行相關(guān)分析，測序質(zhì)量與質(zhì)控結(jié)果均良好，53 835 045條clean reads組裝得到69 151條Unigenes，其長度與reads覆蓋度均合理。Unigenes數(shù)據(jù)巨大，基本涵蓋所有轉(zhuǎn)錄組信息，初步揭示越南安息香根、莖和葉的基因表達特征。

高通量測序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的相關(guān)分析與生物信息學分析密切關(guān)聯(lián)。本研究通過生物信息學分析對所獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行reads濾過、組裝，以及基因注釋和功能的分類等，涉及的軟件有BLAST、Trinity、ESTscan等。

基于BLAST分析，69 151條Unigenes通過4大數(shù)據(jù)庫（Nr、KEGG、KOG和Swiss-port）比對有41 951（60.67%）條被成功注釋，該注釋占比與已經(jīng)報道的甘草[17]、黃精[18]、地黃[19]等物種類似，反映了越南安息香中存在大量未知序列特征及功能的Unigenes，有待進一步探究。

越南安息香轉(zhuǎn)錄組的GO分類揭示其特性與細胞組分、細胞過程和分子功能相關(guān)；通過KOG數(shù)據(jù)庫從基因水平尋找直系同源物種，預測ORF的生物學功能，很大程度上提高了注釋的準確度[20]，該研究獲得較為全面的KOG類群（25個）。進一步通過KEGG數(shù)據(jù)庫對越南安息香轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了94個標準代謝通路，這些通路可能與越南安息香的水分和礦物質(zhì)吸收、光合和呼吸作用等生理過程相關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)20條次生代謝標準通路，涉及了苯丙烷類、黃酮類及萜類等生物合成。其中，參與苯丙烷類生物合成、萜類生物合成的Unigenes分別有276個和91個。越南安息香的次生代謝產(chǎn)物以苯丙烷類和萜類為主[21]，本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為其生物合成通路及調(diào)控提供重要的依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄因子在基因表達上起到重要的調(diào)控作用。C2H2、AP2/ERF、bHLH、MYB等家族在植物細胞苯丙烷類、甲羥戊酸代謝途徑中起到調(diào)控作用[22]。越南安息香Unigenes覆蓋了plantTGdb數(shù)據(jù)庫54個轉(zhuǎn)錄因子家族，涉及到次生代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子較多，說明了越南安息香植物體中復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)應用于構(gòu)建遺傳圖譜和分析遺傳多樣性是其另外的功用[23]，本研究挖掘了越南安息香8 712個Unigenes的10 974個SSRs位點，重復類型以二核苷酸為主，三核苷酸次之，與以二核苷酸為主的當歸[23]的研究一致。雙核苷酸重復以AG/CT類型為主，三核苷酸重復以AAG/CTT類型為主，與當歸[23]、甘草[23]等植物相同。初步認為，植物中SSRs重復以雙核苷酸和三核苷酸重復為主，同時，不同的物種又有所區(qū)別。

越南安息香的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究初步獲得了大量的基因信息，后續(xù)通過進一步系統(tǒng)分析，以期揭示越南安息香中苯丙素脂、三萜類等活性物質(zhì)的生物合成、調(diào)控機制，以及該物種的遺傳特征，為越南安息香資源的開發(fā)及利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Transcriptiomic data analysis of roots, stems, and leaves of

WANG Xiao-min1, XU Hua-hua2, ZHAN Ruo-ting1, MA Xin-ye1

1. Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan, Ministry of Education, Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, South Medicine Research and Development Laboratory of National Engineering Research Center for Chinese Patent Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

To obtain the transcriptome information characteristics of roots, stems, and leaves by transcriptome sequencing of.The roots, stems, and leaves ofwere selected as the research objects, and Illumina HiSeqTM2000 was used to carry out the transcriptome sequencing analysis of these roots, stems, and leaves.A total of 53 835 045 high-quality sequences (clean reads) were obtained from the roots, stems and leaves by transcriptome sequencing, and 69 151 Unigenes were assembled by Trinity de novo, with an average length of 778 nt. BLAST analysis showed that 41 412 (59.89%), 31 189 (45.10%), 25 539 (36.93%), and 16 749 (24.22%) Unigenes were annotated in the Nr, Swiss-port, KOG, and KEGG databases, respectively, which could be classified into 46 branches of cell components, biological processes and molecular functions of the three major classes in GO classification, involving 129 KEGG standard metabolic pathways, of which 31 had secondary metabolic pathways. There were 3 461 protein coding frame sequences, involving 54 families of higher plant transcription factors. MISA software was used to mine 10 974 simple repeat sequences (SSRs), in which the two-base repeat SSRs was the most abundant, with 6 282 (57.24%), and the five-base repeat SSRs were the least, accounting for 2.45%.The transcriptome information characteristics ofroots, stems, and leaves were obtained by high-throughput technology and bioinformatics analysis, which laid a foundation for the study of functional identification, secondary metabolic pathway analysis and regulation mechanism of.

(Pierre) Crail ex Har-tw.; transcriptome; functional genes; metabolism pathway; simple sequence repeats

R282.12

A

0253 - 2670(2021)08 - 2392 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.023

2020-08-06

國家自然科學基金青年基金項目（81102764）；廣東省教育廳重點提升平臺建設(shè)項目—嶺南中藥資源教育部重點實驗室（2014KTSPT016）

王小敏（1990—），男，碩士研究生，研究方向為芳香藥用植物資源學。Tel: 19860209295 E-mail: 807548046@qq.com

馬新業(yè)（1976—），男，博士，副研究員，主要從事中藥資源學研究工作。Tel: 15817036306 E-mail: usermxy@163.com

[責任編輯 時圣明]