王天一，王應祥，尤辰江

綜 述

植物PHD結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特性

王天一，王應祥，尤辰江

復旦大學生命科學學院，植物科學研究所，上海 200433

植物同源結(jié)構(gòu)域(plant homeodomain, PHD)是鋅指結(jié)構(gòu)域家族的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其最主要的功能是可以識別各種組蛋白修飾密碼，包括組蛋白甲基化和乙?；龋淮送釶HD結(jié)構(gòu)域還可以與DNA結(jié)合。含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，或者本身具有組蛋白修飾酶活性，或者可以與各類組蛋白修飾酶相互作用，還有部分與DNA甲基化相關，具有E3泛素連接酶活性，或者還可以作為染色質(zhì)重塑因子，以各種不同的作用方式，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用。本文主要綜述了結(jié)合各種類型組蛋白(包括H3K4me3/0、H3K9me3、H3R2和H3K14ac)以及DNA的PHD結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特點及其結(jié)合特異性、PHD結(jié)構(gòu)域在植物中的進化保守性以及植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的含有PHD結(jié)構(gòu)域蛋白的功能及作用機制，為進一步了解該類蛋白在植物生長發(fā)育過程中如何發(fā)揮作用提供了參考。

PHD結(jié)構(gòu)域；組蛋白密碼；組蛋白修飾識別；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；表觀遺傳

植物同源結(jié)構(gòu)域(plant homeodomain, PHD)是真核生物進化過程中一種保守的鋅指結(jié)構(gòu)域。PHD結(jié)構(gòu)域發(fā)揮功能最主要的方式是識別各類組蛋白修飾，它們對于各類組蛋白修飾的識別也具有一定的特異性，除此之外還可以識別一些DNA序列。含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與生物體的各項生命過程。如在植物中，含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白參與了包括胚胎分生組織萌發(fā)、根系發(fā)育、發(fā)芽、開花、減數(shù)分裂，以及減數(shù)分裂后的花粉發(fā)育等重要過程，對植物的生長發(fā)育具有十分重要的作用[1]。

關于植物中含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，Mouriz等[1]按照其功能分類進行了綜述，本文則是從PHD結(jié)構(gòu)域與各類組蛋白翻譯后修飾的結(jié)合特異性、PHD結(jié)構(gòu)域在植物中的進化保守性，以及各類PHD結(jié)構(gòu)域蛋白的作用機制方面進行論述，主要針對擬南芥()中PHD蛋白的作用機制進行解析，為進一步了解其如何發(fā)揮調(diào)控功能提供參考。

1 PHD的結(jié)合特異性

組蛋白翻譯后修飾主要包括甲基化、乙?；榷喾N形式，這些翻譯后修飾通過招募與組蛋白結(jié)合的效應蛋白來調(diào)控下游基因的表達。其中，識別組蛋白甲基化修飾的結(jié)構(gòu)域主要為PHD結(jié)構(gòu)域和Royal家族的Chromo、Tudor、PWWP (Pro-Trp-Trp- Pro)和MBT (malignant brain tumour)結(jié)構(gòu)域等；而識別組蛋白乙?；闹饕獮?Bromo、DPF (double PHD finger)和YEATS結(jié)構(gòu)域[2]。除此之外，對于DNA的識別主要有螺旋–轉(zhuǎn)角–螺旋(Helix-Turn-Helix, HTH)、鋅指結(jié)構(gòu)、亮氨酸拉鏈(basic Leucine zipper, bZIP)和堿性–螺旋–環(huán)–螺旋(basic Helix- Loop-Helix, bHLH)結(jié)構(gòu)域等，而PHD結(jié)構(gòu)域就屬于鋅指結(jié)構(gòu)域家族。

PHD結(jié)構(gòu)域是一類比較小的蛋白結(jié)構(gòu)域，由50~80個氨基酸殘基組成，其不同家族成員序列表現(xiàn)出較低的氨基酸相似性，但該結(jié)構(gòu)域可以折疊成高度保守的球狀結(jié)構(gòu)[3]。保守的PHD折疊，包含了一對反向平行的雙鏈β-sheet和一個C端的α-helix (不是所有的PHD都有)，2個鋅原子被固定在Cys4-His-Cys3基序上，形成一個“cross-brace”的拓撲結(jié)構(gòu)[4]。

PHD結(jié)構(gòu)域最主要功能是與各種組蛋白修飾特異結(jié)合，作為組蛋白密碼識別器來調(diào)控下游基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，PHD結(jié)構(gòu)域可以識別的組蛋白密碼包括H3K4me3/2/0[5,6]、H3K9me3[7~9]、H3K36[10]、H3R2me2/0[11,12]、H3K14ac以及H4乙?；萚13,14]。研究發(fā)現(xiàn)，PHD結(jié)構(gòu)域通常和其他識別模塊(reader modules)成對出現(xiàn)，例如與Bromo、Chromo、Tudor、PWWP、MBD、SRA或者PHD finger本身，一起作為一個組合來發(fā)揮作用[15]。模塊配對可以顯著地提升PHD的識別能力，提高與組蛋白之間結(jié)合的親和力和特異性，從而提供新的調(diào)控能力。例如BPTF通過PHD-Bromo結(jié)構(gòu)域識別“H3K4me3+H4K16ac”[16]。

本文對已經(jīng)研究出晶體結(jié)構(gòu)以及結(jié)合特性的PHD蛋白進行了總結(jié)。

1.1 識別H3K4me3

PHD與組蛋白H3K4me3的結(jié)合通常依靠一個包含2~4個芳香族殘基的籠子(aromatic cage)。在這個籠子中，K4me3由范德華力和π鍵穩(wěn)定[5](圖1A)。不同的PHD中aromatic cage氨基酸組成不一樣，但是位于序列的相似位置，其中一個色氨酸(Trp)殘基，在位點和殘基類型上都完全保守，是識別結(jié)合甲基化賴氨酸的PHD中最特異的殘基[17]。

在結(jié)合過程中，組蛋白H3的肽段形成第三條反向平行的β鏈，與PHD現(xiàn)存的雙鏈β-sheet配對[5]。PHD蛋白的β1鏈和H3K4me3的R2-T6殘基之間形成分子間氫鍵，穩(wěn)定了結(jié)合復合體的特征骨架[18]。

1.2 識別未修飾的H3

研究表明，BHC80[19]的PHD結(jié)構(gòu)域可以與未修飾的組蛋白H3的前8個殘基結(jié)合(圖1B)，并且當K4位點發(fā)生甲基化時，這個結(jié)合會被阻止，但是K9和K14位點的甲基化不會對其造成影響[19]。類似的，AIRE[20]的PHD結(jié)構(gòu)域也可以與未修飾的組蛋白H3氮端的前8個殘基結(jié)合。

圖1 PHD結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)圖

A：ING2的PHD結(jié)構(gòu)域結(jié)合H3k4me3 (2g6q[23])；B：BHC80的PHD結(jié)構(gòu)域結(jié)合未修飾的H3 (2puy[19])；C：ATRX的PHD結(jié)構(gòu)域識別H3K9me3 (3ql9[24])；D：BPTF的PHD結(jié)構(gòu)域結(jié)合H3K4和H3R2 (2fuu[25])；E：DPF3b的PHD1識別乙酰化修飾(5i3l[26]，黃色代表結(jié)合K14ac的疏水性口袋)；F：BRPF2的PHD2結(jié)構(gòu)域(2lq6[27])。圖中所用模型來自PDB數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)，晶體結(jié)構(gòu)展示軟件為PyMOL (version 2.4)。

與H3K4me3-PHD類似，未修飾的組蛋白H3尾巴也形成一個β鏈，與PHD的β1鏈配對。但是，這一類的PHD很明顯缺失了芳香族的殘基，由一大片的酸性殘基作為替代，并且PHD的第1個與鋅離子結(jié)合的半胱氨酸殘基的N端會存在一個或者一對保守的酸性殘基[19,20]。

1.3 識別H3K9me3

ATRX通過其ADD結(jié)構(gòu)域識別H3K9me3。ADD (ATRX-DNMT3-DNMT3L)結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸殘基，是4個不同的蛋白ATRX、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L共同擁有的結(jié)構(gòu)。ATRX的ADD結(jié)構(gòu)域由1個N端類GATA鋅指(GATA-like finger)、1個PHD結(jié)構(gòu)域、1個長的C端螺旋(C-terminal helix)，通過廣泛的疏水性相互作用組裝在一起，形成一個球狀的結(jié)構(gòu)域[21]。

在ATRX的ADD結(jié)構(gòu)域識別K9me3的過程中，涉及到一個非典型的極性口袋(polar pocket)，該口袋只含有一個芳香族的酪氨酸(Tyr)，并且富含極性的氨基酸(polar residues)[8]。除了分子表面的范德華力以外，K9me3的識別還涉及到了芳香族Tyr203與甲基化賴氨酸之間的陽離子π作用，以及Tyr203、Asp207、Gln219和Ala224與甲基化的賴氨酸之間的非傳統(tǒng)的C-H…O氫鍵的相互作用[21](圖1C)。

類似地，在TRIM33[7]和CHD4[9]中也存在PHD的一個芳香族殘基與K9之間形成π鍵，以及非傳統(tǒng)的氫鍵作用。對于TRIM33，它具有一個PHD-Bromo盒子(cassette)，其Bromo結(jié)構(gòu)域與H3的K14、K18、K23乙?；揎椊Y(jié)合，PHD結(jié)構(gòu)域與H3K9me3結(jié)合。在結(jié)合K9me3的過程中，K9me3與芳香族Trp889之間形成π鍵，與PHD的羰基氧之間形成非傳統(tǒng)的C-H…O氫鍵[7]；而在CHD4的PHD2中，K9me3與芳香族Phe451之間形成π鍵，與其他殘基之間形成氫鍵，這樣的模式穩(wěn)定了PHD-H3K9me3的結(jié)構(gòu)[9]。

1.4 識別H3R2

在許多蛋白(例如BPTF[5]、ING4[22]和UHRF[11]等)中，H3K4和H3R2的識別發(fā)生在同一個PHD的不同位點。在這個過程中，H3R2的側(cè)鏈和H3K4me3分別進入到2個相鄰的識別口袋，這兩個口袋通過一個保守的Trp殘基分隔開(圖1D)。其中K4me3的結(jié)合口袋是芳香族籠子，通過π鍵，疏水相互作用和范德華力，穩(wěn)定PHD與三甲基集團之間的結(jié)合。而R2口袋通常是酸性的，通過Asp、Glu和Gln等殘基與R2之間形成鹽橋或者氫鍵來進行配對[5]。UHRF1的PHD同樣依賴于Asp347和Asp350與H3R2之間形成氫鍵進行結(jié)合[11]。

1.5 識別乙?；?/h3>

識別乙?；M蛋白的PHD通常是串聯(lián)的兩個，例如DPF3b[14]、MOZ[13]和MORF[28]的DPF模塊可以與H3K14以及其他乙?；慕M蛋白尾巴相互作用。

研究發(fā)現(xiàn)，DPF3b的2個串聯(lián)的PHD可以形成一個組合的球狀結(jié)構(gòu)域。其中PHD1可以結(jié)合H3K14ac，PHD2可以結(jié)合H3K4me0和H3R2me0(圖1E)。PHD2結(jié)合H3K4me0的口袋，與前述結(jié)合H3K4me0的PHD類似，擁有酸性和疏水性的殘基。而PHD1結(jié)合H3K14ac的口袋是由Phe264、Leu296、Trp311和Ile314組成的疏水性口袋。PHD1在β2表面產(chǎn)生了一個窄的溝槽，當復合體形成，H3的T11和K14ac的側(cè)鏈插入到這個溝槽中，由一系列氫鍵和范德華力穩(wěn)定[14]。類似的，MOZ通過其Phe211、Leu242、Trp257和Ile260組成相應的疏水性口袋來識別K14ac[13]。

1.6 識別DNA

BRPF1/2[27]中的PHD可以結(jié)合DNA，它們都擁有2個PHD結(jié)構(gòu)域，中間由一個鋅原子連接。BRPF1/2的PHD1對于未修飾的H3有高度的特異性。PHD2呈鞍狀結(jié)構(gòu)，可以與DNA相互作用，與一般的PHD結(jié)構(gòu)域不同，PHD2具有2個與鋅離子配位的組氨酸殘基，其序列特征為C4HC2H，并且還含有一個額外的β3-β4發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖1F)。PHD2對于DNA的結(jié)合能力，可能是由于PHD結(jié)構(gòu)域中具有靜電勢(electrostatic potential)的表面的作用[27]。

2 植物中PHD蛋白功能及作用機制

染色質(zhì)對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要依賴于兩種作用：一種是激活因子，主要依賴于組蛋白的乙?；揎?，使DNA結(jié)構(gòu)變得松散，有利于RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄起始因子與DNA的結(jié)合；另一種是抑制因子，它們可以通過對組蛋白進行抑制型的甲基化修飾，以招募去乙?；?，去掉激活類修飾，進而增強染色質(zhì)的屏障作用。含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，以兩種形式參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，或者本身即擁有組蛋白修飾酶活性，或者可以與各種組蛋白修飾酶相互作用。還有部分PHD結(jié)構(gòu)域蛋白與DNA甲基化相關，具有E3泛素連接酶活性，或者可以作為染色質(zhì)重塑因子，對各種植物的生長發(fā)育以及應對各種逆境脅迫過程著重要作用。

PHD結(jié)構(gòu)域蛋白在植物中廣泛存在。在植物基因組網(wǎng)站Phytozome12中搜索可以發(fā)現(xiàn)，已注釋的擬南芥PHD結(jié)構(gòu)域基因有82個，水稻(L.)有84個，無油樟()有67個。以擬南芥MMD1的同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)該PHD結(jié)構(gòu)域蛋白在植物中廣泛存在，在十字花科和豆科中的同源蛋白數(shù)量最多，在薔薇科、蕓香科、楊柳科、番木瓜科等科目中也有存在，說明該蛋白在植物進化過程中具有保守性，并且可能在多種植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用(圖2)。

圖2 植物中部分PHD結(jié)構(gòu)域蛋白MMD1的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖中展示了部分擬南芥MMD1的同源蛋白的進化關系(序列來源于植物基因組網(wǎng)站Phytozome12)。使用IQ-TREE (version 1.6.12)，以最大似然法(Maximum Likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選用的構(gòu)樹模型為JTT+R6，以葫蘆蘚科、泥炭蘚科和卷柏科的MMD1同源蛋白定根。圖中數(shù)字為分支的自展值，星號“*”代表自展值為100。擬南芥的MMD1分支標為紅色，睡蓮的MMD1同源蛋白分支標為藍色，無油樟的MMD1同源蛋白分支標為綠色。圖中標注了幾個主要的科目，分別為豆科(粉色)、薔薇科(綠色)、楊柳科(紫色)、錦葵科(黃色)、十字花科(藍色)和番木瓜科(橙色)。

對擬南芥中已研究的PHD結(jié)構(gòu)域蛋白進行序列比對，發(fā)現(xiàn)它們都具有保守的C4HC3序列特征(圖3)。根據(jù)擬南芥中含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白發(fā)揮功能的調(diào)控機制不同，可以對其進行具體的分類(表1)：主要包括本身具有組蛋白修飾酶活性(包括本身具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的ATX1/2/3/4/5和ATXR，本身具有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性的IDM1/ROS4)；可以與組蛋白修飾酶相互作用(包括可以與組蛋白去乙?；赶嗷プ饔玫腅BS/SHL，與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用的MMD1、AL、VIN3)，與DNA甲基化相關的MBD9和ORTH，具有E3泛素連接酶活性的SIZ1，以及可以作為染色質(zhì)重塑因子的CHR4和PKL等。

圖3 擬南芥中PHD結(jié)構(gòu)域的序列比對

黑色表示同源性為100%，粉色表示同源性為75%，藍色表示同源性為50%?？梢钥闯鯬HD結(jié)構(gòu)域保守的C4HC3氨基酸殘基序列特征。圖中各蛋白對應的TAIR基因號分別為：ATX1 (At2g31650)、TX2 (At1g05830)、ATX3 (At3g61740)、ATX4 (At4g27910)、ATX5 (At5g53430)、ATXR5 (At5g09790)、ATXR6 (At5g24330)、ATORC1A (At4g14700)、ATORC1B (At4g12620)、AL1 (At5g05610)、AL2 (At3g11200)、AL3 (At3g42790)、AL4 (At5g26210)、AL5 (At5g20510)、AL6 (At2g02470)、AL7 (At1g14510)、CHR4 (At5g44800)、CHR6 (At2g25170)、EBS (At4g22140)、HAT3.1 (At3g19510)、ING1 (At3g24010)、ING2 (At1g54390)、MMD1 (At1g66170)、MBD9 (At3g01460)、MS1 (At5g22260)、OBERON1 (At3g07780)、OBERON2 (At5g48160)、PTM (At5g35210)、PRHA (At4g29940)、ROS4 (At3g14980)、SHL1 (At4g39100)、SIZ1 (At5g60410)、SCC2 (At5g15540)、VIM1 (At1g57820)、VIM2 (At1g66050)、VIM3 (At5g39550)、VIM4 (At1g66040)、VIM5 (At1g57800)、VIN3 (At5g57380)。

表1 擬南芥中PHD蛋白的特征與功能

續(xù)表

2.1 本身具有組蛋白修飾酶活性

2.1.1 本身具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性

擬南芥()基因分為兩個亞家族，分別為/亞家族和//亞家族。ATX1和ATX2蛋白包含ePHD結(jié)構(gòu)域(extended plant homeodomain)和SET結(jié)構(gòu)域。ePHD結(jié)構(gòu)域包含1個N端pre-PHD (C2HC Zinc finger)、1個長的連接區(qū)域和1個PHD (C4HC3Zinc finger)，ePHD結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合雙鏈DNA但是不能結(jié)合組蛋白。而SET結(jié)構(gòu)域使ATX1/2具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性。ATX1作用于H3K4me3，而ATX2作用于H3K4me2，這兩個組蛋白修飾都是活躍轉(zhuǎn)錄的標志。

ATX1參與根系、葉片和花器官的發(fā)育以及一些逆境脅迫基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[29]。研究表明，ATX1在調(diào)控目標基因表達時具有兩種不同的作用：一種是作為共同激活子參與前起始復合物PIC的形成，招募RNA聚合酶II和TATA結(jié)合蛋白；另一種是被磷酸化的RNA聚合酶II招募到轉(zhuǎn)錄起始位點下游行使H3K4三甲基化作用[31]。ATX1催化的H3K4me3不作用于轉(zhuǎn)錄起始，而是作用于活躍轉(zhuǎn)錄的延伸[30]。與其他的PHD結(jié)構(gòu)域結(jié)合H3K4me3的功能不同，ATX1的ePHD結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合PI5P (phosphatidy-linositol 5-phosphate)，影響ATX1的亞細胞定位，從而調(diào)控一些特異依賴于ATX1的基因的表達[71]。

ATX2與ATX1擁有相似的序列，但是它們在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄方面具有非冗余的功能，在作用于同一個基因的調(diào)控時，有不同的靶向特異性，并且使用了不同的分子生物學機制[32]。例如，ATX1和ATX2都使的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。在突變體中，的H3K4me2的標記消失伴隨著基因轉(zhuǎn)錄水平的降低，并且H3K4me3不是轉(zhuǎn)錄所需要的(在活躍轉(zhuǎn)錄的野生型中也沒有H3K4me3)。說明ATX2導致的H3K4me2累積對轉(zhuǎn)錄是必要的，而ATX1則并不對的核小體直接進行修飾，發(fā)揮了間接的調(diào)控作用[32]。

ATX3、ATX4、ATX5同樣包含PHD結(jié)構(gòu)域，并且可能編碼了H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶，參與H3K4的二甲基化和三甲基化。ATX3/4/5具有冗余的功能，可以調(diào)控一系列作用于營養(yǎng)生長和生殖生長的基因。它們是迄今為止在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)的唯一具有H3K4me2甲基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白[34]。

ATXR5/6 (ARABIDOPSIS TRITHORAX-RELA-TED PROTEIN 5/6)是擬南芥中另一對含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，具有H3K27me1甲基轉(zhuǎn)移酶活性。ATXR5/6參與植物中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因沉默和異染色質(zhì)的DNA復制過程[72]。和突變體表現(xiàn)出異染色質(zhì)成分(heterochromatic elements)、轉(zhuǎn)座子和重復序列的轉(zhuǎn)錄激活。ATXR5/6的PHD結(jié)構(gòu)域可以識別未甲基化的H3K4，參與SET結(jié)構(gòu)域結(jié)合輔因子以及促進H3K27me1的過程[35]。

除此之外，在酵母和人類的PHD蛋白中也有類似的例子。釀酒酵母()的Spp1是一個含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，同時也是組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶Set1(COMPASS)復合體的成員。Spp1的PHD結(jié)構(gòu)域結(jié)合組蛋白H3K4，并且可以調(diào)控甲基轉(zhuǎn)移酶COMPASS的活性[73]。在人類中的一些蛋白，包括PHF2、PHF8和KIAA1718等，除了包含PHD結(jié)構(gòu)域以外，還包含1個具有組蛋白去甲基化酶活性的JmjC (Jumonji-C)結(jié)構(gòu)域。這些蛋白的PHD結(jié)構(gòu)域，在活躍轉(zhuǎn)錄基因的啟動子區(qū)域，與含有H3K4me3的核小體結(jié)合。而JmjC結(jié)構(gòu)域則可以移除與轉(zhuǎn)錄抑制相關的組蛋白H3K9、H3K27的單、雙甲基化以及H4K20的單甲基化。這樣的雙重作用，確保了基因在被轉(zhuǎn)錄激活之后，組蛋白轉(zhuǎn)錄抑制標記能夠恰當?shù)匾瞥齕74]。

2.1.2 本身具有組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性

IDM1 (INCREASED DNA METHYLATION1)是一個組蛋白H3乙?；D(zhuǎn)移酶，具有1個MBD結(jié)構(gòu)域(methyl-CpG-binding domain)、1個PHD結(jié)構(gòu)域和1個組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域[37]。MBD結(jié)構(gòu)域參與識別甲基化的DNA；PHD結(jié)構(gòu)域可以識別未甲基化的H3K4。IDM1對于DNA甲基化具有負面調(diào)控，阻止高度同源的多拷貝基因和其他重復序列的DNA高度甲基化，其抑制作用表現(xiàn)在兩個方面：第一，IDM1的H3乙?；钚钥梢砸种艱NA高度甲基化，乙?；腍3(H3K18Ac、H3K23Ac)創(chuàng)造了一個允許5-甲基胞嘧啶DNA糖苷酶(參與DNA脫甲基化)作用的染色質(zhì)環(huán)境；第二，PHD結(jié)構(gòu)域抑制DNA高度甲基化。一方面，PHD結(jié)構(gòu)域的突變，會引起IDM1乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的喪失，這也說明了PHD結(jié)構(gòu)域可以不依賴于其結(jié)合組蛋白H3的功能，去影響IDM1乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性；另一方面，PHD結(jié)構(gòu)域只能識別未甲基化的H3K4，其與H3K4me0的結(jié)合會被H3K4me2/3抑制。因此，由于PHD結(jié)構(gòu)域的存在，IDM1在H3K4me2/3水平高的位點與甲基化的DNA結(jié)合是被抑制的[75]。

在釀酒酵母中，Yng1蛋白包含PHD finger結(jié)構(gòu)域，并且該蛋白是NuA3 HAT復合體(組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶)的組成部分。Yng1通過PHD結(jié)構(gòu)域識別H3K4me3，增強了NuA3 HAT復合體對組蛋白H3底物作用的活性，使H3K14乙酰化，從而激活基因的表達[76]。

2.2 與組蛋白修飾酶相互作用

2.2.1 與組蛋白去乙?；赶嗷プ饔?/p>

()和()是擬南芥中的兩個旁系同源基因，都包含PHD結(jié)構(gòu)域和BAH (bromo-adjacent homology)結(jié)構(gòu)域，參與染色質(zhì)介導的開花抑制和種子休眠。研究發(fā)現(xiàn)，的過量表達還會引起植物育性的降低[77]。SHL和EBS在調(diào)控開花時間上發(fā)揮重要作用，主要通過其PHD結(jié)構(gòu)域識別H3K4me2和H3K4me3，分別結(jié)合到和(和都是開花調(diào)節(jié)基因[78])的調(diào)控區(qū)域。這兩種PHD蛋白通過結(jié)合組蛋白去乙?；窰DA6 (HISTONE DEACETYLASE 6)，阻止高水平的H3乙?；?，維持了和的不活躍的染色質(zhì)構(gòu)象[79]。EBS與HDA6的相互作用，說明組蛋白甲基化和乙酰化對于開花時間的精確控制是一個關鍵的因素。另外，在和參與的種子休眠調(diào)控的過程中，組蛋白甲基化和乙?；揎椆餐瑓f(xié)作對于種子休眠的精確調(diào)控也十分重要[39]。和在植物中高度保守，但是在其他真核生物中卻沒有，說明這些基因介導的調(diào)控方式是植物中的一種特有的機制。

2.2.2 與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用

擬南芥的MMD1 (MALE MEIOCYTE DEATH 1)對于植物減數(shù)分裂過程十分重要[40]。其PHD結(jié)構(gòu)可以識別H3K4me2/3，通過結(jié)合目標基因啟動子區(qū)域的組蛋白標記，招募其他的調(diào)控因子到相同的位點，從而調(diào)控基因的表達[41]。最近研究發(fā)現(xiàn)，MMD1擁有另一個保守的MMD結(jié)構(gòu)域，其與JMJ16 (組蛋白去甲基化酶，具有H3K4me3去甲基酶活性[80])的FYR-C結(jié)構(gòu)域相互作用，從而拓展了JMJ16的H3K9me3去甲基酶活性，使目標基因啟動子區(qū)域的抑制基因表達的組蛋白修飾減少，從而促進了基因表達，包括編碼濃縮蛋白CAP-D3的基因表達。在這個過程中，PHD結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合H3K4me3，使JMJ16能夠準確定位到基因的啟動子區(qū)域[42]。

擬南芥中AL (ALFIN-LIKE)蛋白是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，對于植物的生長發(fā)育，以及應對低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫具有重要的調(diào)控作用[44,46]。AL蛋白家族包括AL1、AL2、AL3、AL4、AL5、AL6和AL7，除AL3以外都能通過PHD結(jié)構(gòu)域與H3K4me3和H3K4me2結(jié)合來調(diào)控目標基因的表達[45]。在種子萌發(fā)時，AL蛋白通過與PRC1蛋白相互作用，招募PRC2 (一個保守的H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶[81])從而促進H3K27me3的積累，將種子發(fā)育相關基因的活躍轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴换钴S狀態(tài)，對于種子萌發(fā)和早期的幼苗生長十分重要[43]。

植物的春化作用中所需的表觀遺傳學基因沉默過程，需要PRC2和2個PHD finger蛋白—VRN5和VIN3的參與。VIN3蛋白的PHD結(jié)構(gòu)域與PRC2的相互作用被認為是PcG家族調(diào)控基因表達的保守機制[82]，PHD結(jié)構(gòu)域蛋白在增強PRC2活性上發(fā)揮了重要作用。高水平的H3K27me3能夠穩(wěn)定基因的沉默狀態(tài)，PHD-PRC2復合體使基因的H3K27me3水平升高，從而使其保持沉默[82]。

類似的調(diào)控過程在果蠅()和哺乳動物中也存在。哺乳動物的PHF1蛋白擁有1個N端Tudor結(jié)構(gòu)域和2個PHD結(jié)構(gòu)域，是PRC2的組成部分。PHF1包含兩個PHD finger結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，可以直接與PRC2的催化亞基EZH2 (甲基轉(zhuǎn)移酶活性)相互作用[83]。在果蠅中，(的同源基因)和()(的同源基因)也可以互相結(jié)合[84]，說明PHF1的PHD finger功能的保守性[85]。此外，研究發(fā)現(xiàn)在沒有H3K36me3的情況下，PHF1可以增強PRC2的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，這可能是由于PHD finger結(jié)構(gòu)域與其他組蛋白翻譯后修飾(例如未修飾的H3或H3K4me3，與H3K27me3沒有空間沖突)相互作用[86]。

2.3 與DNA甲基化相關

AtMBD9 (METHYL-CPG BINDING DOMAIN 9)蛋白擁有5個與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾調(diào)控基因表達相關的結(jié)構(gòu)域，分別為1個MBD結(jié)構(gòu)域、2個PHD結(jié)構(gòu)域、1個Bromo結(jié)構(gòu)域、1個FYRN結(jié)構(gòu)域(N-terminal phenylalanine/tyrosine-rich domain)和1個FYR結(jié)構(gòu)域(C-terminal phenylalanine/tyrosine-rich domain)[53]。AtMBD9是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過DNA甲基化和組蛋白乙酰基化這兩種表觀遺傳途徑，分別間接和直接調(diào)控基因的表達，從而影響擬南芥的生長發(fā)育[52]。研究表明，AtMBD9突變體出現(xiàn)DNA高度甲基化，并且AtMBD9通過調(diào)控H4乙?；瘉碛绊戦_花調(diào)節(jié)基因的表達，從而調(diào)節(jié)開花時間，其突變體表現(xiàn)出早開花和根系分支增多的表型[53]。MBD結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合甲基化的DNA，Bromo結(jié)構(gòu)域可能發(fā)揮了催化組蛋白乙酰化反應的作用，因為該結(jié)構(gòu)域在其他組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶中經(jīng)常存在[87]，而PHD結(jié)構(gòu)域的功能還沒有具體的研究。

擬南芥/(/)基因家族有6個成員，是哺乳動物(,,)的直系同源基因群[55]。-編碼的蛋白擁有1個PHD結(jié)構(gòu)域、2個RING結(jié)構(gòu)域和1個SRA(SET RING associated)結(jié)構(gòu)域。研究表明，ORTH蛋白在體外擁有E3泛素連接酶活性，并且可以介導DNA甲基化。而第6個成員/(/)只有1個RING結(jié)構(gòu)域和1個SRA結(jié)構(gòu)域，其SRA結(jié)構(gòu)域作用于結(jié)合甲基化的DNA[88]。而在人的UHRF1中，PHD和SRA結(jié)構(gòu)域共同作用，使其結(jié)合到甲基化的H3K9上[89]。

正確的甲基化對于基因調(diào)控十分重要。MET1 (DNA METHYLTRANSFERASE 1)作用于DNA的CG甲基化。研究發(fā)現(xiàn)，ORTH/VIM可以通過識別MET1建立的CG甲基化在相應的位點積累，成為MET1介導的DNA甲基化途徑中關鍵的組成部分[54]。

此外，ORTH2/VIM1的PHD結(jié)構(gòu)域可以與NtSET (SU(VAR)3-9蛋白，煙草()中的一種甲基轉(zhuǎn)移酶)相互作用[90]。因此，該PHD結(jié)構(gòu)域是一個蛋白互作結(jié)構(gòu)域，可能通過招募H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶，在DNA甲基化和H3K9組蛋白修飾之間建立聯(lián)系。

在VIM突變體的靶基因上，活躍的染色質(zhì)標記如H3K4me3和H3K9/K14ac明顯增加，而抑制的染色質(zhì)標記如H3K9me2和H3K27me3減少。此外，VIM的不足會引起異染色質(zhì)染色中心(chromocenters) H3K9me2的明顯減少[54]。因此，VIM蛋白通過調(diào)控激活和抑制的組蛋白修飾，使靶基因沉默，在協(xié)調(diào)組蛋白修飾和DNA甲基化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變方面發(fā)揮了重要作用。

2.4 具有E3泛素連接酶活性

類泛素化(SUMOylation)在調(diào)控真核生物生長發(fā)育的多個方面發(fā)揮了重要的作用。Siz/PISA家族是一類具有SP-RING特征結(jié)構(gòu)域的SUMO E3泛素連接酶，具有保守的特征結(jié)構(gòu)域，包括SAP、PINIT和PHD finger結(jié)構(gòu)域(只有植物成員具有PHD結(jié)構(gòu)域，動物和酵母中沒有)[91]。

擬南芥通過調(diào)控基因的表達，參與植物的生長發(fā)育以及應對干旱、低鹽的脅迫的過程[57]。AtSIZ1包含了5個結(jié)構(gòu)域，分別是SAP結(jié)構(gòu)域、Siz/PIAS-RING結(jié)構(gòu)域(作用于發(fā)揮SUMO E3連接酶活性)、PINIT結(jié)構(gòu)域、SXS結(jié)構(gòu)域(促進與SUMO的結(jié)合)以及PHD結(jié)構(gòu)域。研究人員推測其PHD結(jié)構(gòu)域與染色質(zhì)重塑復合體有關，或者可能具有E3泛素連接酶活性[58]。

在水稻中OsSIZ1的SP-RING結(jié)構(gòu)域主要發(fā)揮了類泛素化作用。OsSIZ1的PHD結(jié)構(gòu)域可以識別H3R2me2和H3K4me3，研究指出PHD結(jié)構(gòu)域可能和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域SAP一起協(xié)同作用，通過使一些效應因子(包括轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白、HDAC組蛋白去乙?；傅?發(fā)生類泛素化，從而調(diào)控基因的表達[56]。

人類的KAP1也是一個含有PHD結(jié)構(gòu)域且具有E3泛素連接酶活性的蛋白。KAP1的PHD結(jié)構(gòu)域作為E3連接酶，介導了分子內(nèi)的Bromo結(jié)構(gòu)域的類泛素化，參與了基因沉默[92]。

2.5 是染色質(zhì)重塑因子

依賴于ATP的染色質(zhì)重塑因子主要包括：SWI/ SNF (SWITCH/SUCROSE NON-FERMENTING)、ISWI (IMITATION SWITCH)、INO80 (INOSITOL 80)和CHD (CHROMODOMAIN-HELICASE-DNA BIN-DING)。其中CHD是依賴于ATP的染色質(zhì)重塑因子，在調(diào)控基因表達方面具有重要作用。CHD蛋白可以分為3個亞家族，分別為Chd1亞家族(也稱為CHD1蛋白)、Mi-2亞家族(也稱為CHD3蛋白)和CHD7亞家族[61]。

擬南芥中Mi-2亞家族有3個成員(PKL、CHR4和CHR7)，水稻中也有3個(CHR207、CHR729和CHR703)。這些蛋白除了CHR7以外，都擁有1個PHD結(jié)構(gòu)域和2個chromo結(jié)構(gòu)域。擬南芥PKL和CHR4作用于DNA損傷應答[59]，與水稻CHR729一樣在調(diào)控植物生長和響應脅迫基因的表達中發(fā)揮重要的作用[60]。

PKL對一些基因的表達具有抑制作用，這些基因位點上有H3K27me3富集，推測該抑制作用與H3K27me3有關。PKL還可以激活一些基因的表達，它出現(xiàn)在例如ACT7 (ACTIN7)和UBQ10 (POLYU-BIQUITIN 10)這類不需要依賴PKL表達的基因的啟動子區(qū)域，并且促進普遍的染色質(zhì)重塑過程[62]。CHR7沒有PHD結(jié)構(gòu)域，但是與PKL在激活基因表達上擁有重疊的功能，這說明PHD結(jié)構(gòu)域可能對激活轉(zhuǎn)錄表達是不必要的。

2.6 與bHLH型的轉(zhuǎn)錄因子相互作用

(TDR interacting protein 3)是水稻中的一種雄性不育基因，包含PHD結(jié)構(gòu)域，主要于花藥發(fā)育期間在絨氈層和小孢子中表達[93]。TDR是一個bHLH型的轉(zhuǎn)錄因子，通過直接激活其靶基因的表達來調(diào)控絨氈層的發(fā)育和退化、脂質(zhì)的代謝以及花粉的形成等過程[93]。研究發(fā)現(xiàn)，TIP3可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子與TDR相互作用，從而影響與絨氈層程序性死亡和花粉壁發(fā)育相關基因的表達；并且酵母雙雜交實驗表明，TIP3的PHD結(jié)構(gòu)域可以在在酵母中與3個bHLH型的轉(zhuǎn)錄因子TDR、EAT1和TIP2相互作用[93]。

因此，含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白還可能是通過不依賴于組蛋白修飾的方式，直接與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，將轉(zhuǎn)錄因子招募到基因的啟動子區(qū)域，從而發(fā)揮基因表達調(diào)控的功能。

3 結(jié)語與展望

在植物中，含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與了對植物生長發(fā)育具有重要作用的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。正如擬南芥中的PHD蛋白，參與種子萌發(fā)、根系發(fā)育、發(fā)芽、開花、減數(shù)分裂，以及減數(shù)分裂后的花粉發(fā)育等過程(圖4)。

基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與各種染色質(zhì)修飾以及DNA甲基化密切相關。一般認為DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制相關，組蛋白乙酰化促進轉(zhuǎn)錄激活，而組蛋白甲基化則通過招募各種下游效應蛋白來發(fā)揮激活(H3K4me)或抑制(H3K9me)轉(zhuǎn)錄的修飾效應[94]。PHD結(jié)構(gòu)域由于不同的氨基酸序列組成和結(jié)構(gòu)特異性，對于不同的組蛋白乙?；图谆揎椀慕Y(jié)合也具有特定的偏好性。因此，對于PHD結(jié)構(gòu)域結(jié)合特異性的精準研究，將會對其如何發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能具有十分重要的指示作用。目前已有研究在PHD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性的基礎上，開發(fā)相應的化學探針(chemical probes)以干擾其與組蛋白H3之間的相互作用[95]，以及通過一些小分子抑制子(small molecule inhibitors)來競爭結(jié)合PHD結(jié)構(gòu)域[96]。此外，開發(fā)具有E3泛素連接酶活性的PHD結(jié)構(gòu)域配體以降解PHD蛋白也可能成為未來的一種研究思路[95]。

圖4 擬南芥中PHD結(jié)構(gòu)域蛋白的功能示意圖

圖中均為擬南芥的PHD結(jié)構(gòu)域蛋白?？梢钥闯觯@些蛋白參與的生長發(fā)育相關的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程主要包括：種子萌發(fā)、根系發(fā)育、發(fā)芽、開花、減數(shù)分裂，以及減數(shù)分裂后的花粉發(fā)育等過程，并且還有蛋白與DNA甲基化相關。同時，對于植物的逆境脅迫和DNA損傷修復過程也發(fā)揮了重要的作用。

此外，含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白不僅在植物中保守存在，在人類基因組中也有約180多個含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，這些蛋白同樣具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞周期和凋亡等方面的重要作用。對于植物PHD結(jié)構(gòu)域蛋白的研究，可以更好地了解PHD結(jié)構(gòu)域蛋白的作用機制，以運用于人類的腫瘤和疾病治療。例如，在基因靶向治療中，可以將外源性的PHD結(jié)構(gòu)域蛋白導入人體，依靠PHD結(jié)構(gòu)域?qū)M蛋白密碼的識別，從而靶向特定基因的轉(zhuǎn)錄激活和抑制，以達到抑制腫瘤基因表達等目的。

綜上所述，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中，含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白通過與不同的表觀遺傳效應蛋白(例如組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶等)相互作用，以協(xié)調(diào)恰當?shù)娜旧|(zhì)修飾狀態(tài)或者DNA甲基化狀態(tài)，共同調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達。因此，研究含有PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，對于植物生長發(fā)育和逆境脅迫等調(diào)控過程的解析具有十分重要的意義。

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Structural and functional characteristics of plant PHD domain-containing proteins

Tianyi Wang, Yingxiang Wang, Chenjiang You

,,,,

Plant homeodomain (PHD) is a class of transcription factor in the Zinc finger domain family. The most important function of which is to recognize various histone modifications, including histone methylation and acetylation, etc. They can also bind to DNA. Proteins with PHD domains, some of which possess histone modification enzyme activity, or can interact with histone modification enzymes, and some are associated with DNA methylation, with E3 ubiquitin ligase activity, or even can be chromatin remodeling factors. As transcriptional regulators, they play an important role in plant growth and development. In this review, we summarize the structural features and substrate binding specificity of PHD domains (including H3K4me3/0, H3K9me3, H3R2, H3K14ac) and DNA, the conservation of plant PHD domain in evolution, the molecular mechanism of known PHD domain-containing proteins in plants, providing a reference for further understanding of the involvement of these proteins during plant growth and development.

plant homeodomain (PHD); histone code; histone modification reader; transcriptional regulation; epigenetics

2020-12-01;

2021-02-09

國家自然科學基金項目(編號：31925005)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31925005)]

王天一，在讀博士研究生，研究方向：植物減數(shù)分裂。E-mail: 20110700106@fudan.edu.cn

尤辰江，博士，青年研究員，研究方向：植物表觀遺傳。E-mail: cjyou@fudan.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-412

2021/3/11 17:17:54

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210310.1027.002.html

(責任編委: 宋任濤)