李炳旻，唐浩文，馬 奎，楊宇光，張翠萍

1 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新研究部 創(chuàng)傷修復與組織再生研究中心，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 肝膽胰外科醫(yī)學部，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心 皮膚科，北京 100084

衰老是發(fā)生于生物有機體的一個普遍特征[1]。在多細胞生物中，衰老表現(xiàn)為分子水平、細胞水平和組織水平的功能逐漸喪失。衰老是一項不可逆轉(zhuǎn)的自然進程，越來越多的研究證據(jù)表明一些不良因素可加速細胞、組織、甚至機體的衰老，如感染、缺氧、光老化等[2]。近年來，高糖引起的細胞衰老在各個器官得到了普遍的證實[3]。在慢性高糖環(huán)境的作用下，細胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，ROS可加速端?？s短、引起DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)并導致衰老相關的細胞生長停滯[4-6]。成纖維細胞在慢性糖基化過程中，其細胞骨架的Vimentin蛋白是糖基化終產(chǎn)物的作用靶點之一，長期刺激可導致細胞外基質(zhì)的機械性能及其與細胞的相互作用均被改變，進而影響細胞的生物學功能[7-9]。本文旨在比較不同濃度和不同作用時間高糖DMEM培養(yǎng)液對成纖維細胞的老化作用，為高糖誘導成纖維細胞老化的體外模型建立提供一定 的參考。

材料和方法

1 實驗設備和試劑 CO2細胞培養(yǎng)箱，賽默飛公司；熒光顯微鏡，萊卡公司；Realtime qPCR，賽默飛公司；中性蛋白酶Ⅱ，北京索萊寶科技有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)液，Gibco；DMEM高糖培養(yǎng)液，Gibco；200 g/L葡萄糖溶液，Gibco；Cell Counting Kit-8試劑盒，Dojindo東仁化學科技有限公司；β-半乳糖苷酶染色試劑盒，Sigma；TRIZOL，Invitrogen；FastKingcDNA第一鏈合成預混試劑，天根生化科技有限公司；Super-RealPreMix Plus (SYBR Green)，天根生化科技有限 公司。

2 原代成纖維細胞分離及培養(yǎng) 皮膚來源于一名20歲健康男性包皮環(huán)切術所切除的包皮組織。碘伏浸泡10 min后，用PBS漂洗3 ～ 5次，直至漂洗液清亮透明；去除脂肪組織和結締組織后，將標本剪成1 mm3的組織塊，置于含0.5%中性蛋白酶Ⅱ的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，4℃消化過夜。收集可覆蓋3.5 cm培養(yǎng)皿底部的真皮組織塊，加入1 mL血清，然后將組織均勻地貼附于T25培養(yǎng)瓶下表面，垂直置于37℃細胞培養(yǎng)箱中1 h，之后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)平放，緩慢加入少許DMEM培養(yǎng)液，以剛剛浸沒組織塊為宜。第2天再向瓶中加入少許培養(yǎng)液。之后每3 d換液1次，并在倒置顯微鏡下觀察。約4 d后組織塊周圍可見少量梭形的細胞爬出，7 d后組織塊周圍可見大量呈編織狀排列的細胞。PBS沖洗，消化，傳代，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基傳代培 養(yǎng)至第5代(P5)。

3 細胞增殖能力的測定 本實驗采用CCK-8實驗對細胞增殖能力進行評估。首先，將成纖維細胞接種于4個96孔板中，接種細胞密度約為2×103/孔，在培養(yǎng)箱中過夜，使細胞充分貼壁。次日，在96孔板中，根據(jù)分組情況，分別給予含5.5 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L、35 mmol/L和45 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，每組設3個復孔。并于1 d、3 d和5 d時，隨機抽取一個96孔板進行光密度值(optical density，OD)測定。首先，棄去細胞培養(yǎng)液，將CCK-8溶液與DMEM培養(yǎng)基按1∶10的比例混勻后，每孔加入110 μL混合液，同時在無細胞的孔中加入等量PBS作為空白對照。37℃避光孵育2 h后用酶標儀(Biotek，VT，USA)分別測量每個孔在450 nm波 長處的吸光度，即OD值。

4 細胞遷移能力的測定 通過劃痕實驗檢測成纖維細胞在不同培養(yǎng)條件下的遷移能力。首先，將成纖維細胞接種在6孔板中，培養(yǎng)12 h，待細胞完全貼壁后更換為分別含5.5 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L、35 mmol/L和45 mmol/L葡 萄 糖的DMEM培養(yǎng)基。待細胞達到90% ～ 100%單層融合時，用200 μL移液槍頭劃一條直線，PBS洗滌3次后加入不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于0 h和24 h時拍攝照片，比較不同組間細胞的遷移情況，并通過細胞重新覆蓋的面積評估細胞的遷移能力，其計算公式：(初始空白面積－實時空 白面積)/初始空白面積×100%。

5 細 胞 衰 老 判 定 β-半 乳 糖 苷 酶(senescenceassociated β-galactosidase，SA-β-Gal)活性水平上調(diào)是細胞衰老的重要特征之一。因此，我們采用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(Sigma)檢測各組細胞SA-β-gal的表達，從而判斷細胞是否發(fā)生衰老。通過β-半乳糖苷酶染色，衰老細胞在顯微鏡下呈現(xiàn)出藍色。首先，將細胞接種至6孔板中，分別用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)。第3天和第5天時觀察SA-β-gal著色情況。吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，每孔加入1 mL固定液室溫下固定10 min；配制SA-β-gal染色溶液，每孔加入1 mL，封包后37℃水浴過夜。次日于光學顯微鏡下觀察。分別計數(shù)藍色細胞和總細胞數(shù)，確定SA-β-gal陽性細胞 的比例。

6 qRT-PCR檢測細胞p16、p21和p53的基因表達 將細胞接種在6孔板中，并在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d；每孔依次加入1 mL Trizol(Invitrogen)，200 μL氯仿，500 μL異丙醇，提取細胞中的RNA；75%乙醇洗滌純化RNA后風干；加入DEPC水溶解沉淀后，用分光光度計測量各組RNA濃度；使用 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒(FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix)合成cDNA，再分別加入GAPDH、p 53、p21和p16引物進行基因擴增。

7 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics(IBM，Armonk，NY)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t法及SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計 學意義。

結 果

1 高 糖 環(huán) 境 導 致 成 纖 維 細 胞 增 殖 能 力 下 降 CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)，與5.5 mmol/L組相比，隨著葡萄糖濃度的升高，成纖維細胞的增殖能力逐漸增高，并于25 mmol/L時達到頂峰；當給予更高濃度的葡萄糖環(huán)境(≥ 35 mmol/L)進行培養(yǎng)時，成纖維細胞的增殖能力逐漸下降。該結果說明適當?shù)母咛黔h(huán)境(25 mmol/L)可促進成纖維細胞的增殖，而過高的葡萄糖濃度(≥ 35 mmol/L)則會對成纖維細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。第1天、第3天時，35 mmol/L和45 mmol/L組的OD值與5.5 mmol/L組比較無統(tǒng)計學差異；而第5天時35 mmol/L和45 mmol/L組OD值低于5.5 mmol/L組(P＜0.05)(圖1)。說明隨著高糖環(huán)境作用時間的延長，成纖維細胞的增殖能力受損更加 顯著。

2 高糖環(huán)境損害成纖維細胞的遷移能力 劃痕試驗發(fā)現(xiàn)，當葡萄糖濃度為15 mmol/L和25 mmol/L時，成纖維細胞的遷移能力較5.5 mmol/L時提高；而當葡萄糖濃度 ≥ 35 mmol/L時，成纖維細胞 的遷移能力明顯下降(P＜0.01)(圖2)。

3 高糖環(huán)境使成纖維細胞SA-β-gal表達水平升高 當不同葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)液作用第3天時，各組β-半乳糖苷酶染色陽性的成纖維細胞均較少，差異無統(tǒng)計學意義。而第5天時，采用35 mmol/L和45 mmol/L葡萄糖濃度DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的成纖維細胞中β-半乳糖苷酶染色陽性的比 例顯著增加(P＜0.01)(圖3)。

4 高 糖 環(huán) 境 導 致 成 纖 維 細 胞p53、p21和p16表達上調(diào) 與5.5 mmol/L組相比，35 mmol/L組和45 mmol/L組成纖維細胞p53、p21和p16的表達均上調(diào)(P＜ 0.05)。說明當培養(yǎng)液中葡萄糖濃度 ≥35 mmol/L時，成纖維細胞出現(xiàn)衰老相關表型(p16表達上調(diào))(圖4)。由此推測，高糖誘導成纖維細胞老化的分子機制可能是通過上調(diào)p53/p21通路 ，進而引起p16表達水平的升高。

圖 1 CCK-8實驗中各組細胞在1 d、3 d、5 d時OD值的變化(aP＜0.05)Fig.1 OD value of each group at day 1, day 3 and day 5 by CCK-8 assay (aP＜0.05)

討 論

細胞衰老是一種自然發(fā)生的、不可避免的過程[10]。然而，當細胞受到持續(xù)性促增殖信號刺激，或端粒和線粒體功能損害時[11-12]，亦會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，這是細胞對損傷的反應。損傷為一過性時，細胞會出現(xiàn)短暫的細胞周期阻滯，伴p53及其下游信號分子p21表達上調(diào)。應激解除后細胞即可恢復增殖，而不會發(fā)生細胞衰老。當損傷持續(xù)存在時，p53/p21下游的CDKN2A位點激活，產(chǎn)生大量p16，進而導致不可逆的細胞生長停滯。在這一階段，DNA發(fā)生持續(xù)性損傷，此時細胞出現(xiàn)特征性的衰老細胞相關表型[13]，包括：1)衰老相關異染色質(zhì)位點激活；2)DNA損傷；3)β半乳糖苷酶上調(diào)；4)p16表達上調(diào)；5)端粒縮短；6)細胞增殖能力下降。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)當葡萄糖濃度 ≥35 mmol/L時，成纖維細胞的增殖和遷移能力顯著下降。β-半乳糖苷酶在3 d時差異不顯著，而5 d時可見顯著組間差異，說明該指標特異性強，可作為監(jiān)測細胞是否發(fā)生衰老的特征性指標。Chen等[14]報道，4 d以上的持續(xù)性刺激方可導致細胞分裂進程停滯及不可逆性衰老進程的發(fā)生[15]。PCR結果表明，在高糖環(huán)境的作用下，成纖維細胞p53、p21和p16的表達上調(diào)，說明p53/p21通路可能是高糖環(huán)境導致細胞老化的作用靶點?？傊?，適當?shù)钠咸烟菨舛?25 mmol/L)可提高成纖維細胞的增殖和遷移功能，而過高濃度(≥35 mmol/L)會抑制成纖維細胞的生物學功能，誘導細胞發(fā)生老化，且該作用呈時間和濃度依賴性。本研究為高糖誘導成纖維細胞衰老體外模型的建立提供了一定的理論依據(jù)，該模型可用于拮抗高糖引發(fā)的細胞衰老的藥物研究體外實驗，或高糖引發(fā)細胞衰老機制的進一步探索。

圖 4 不同濃度葡萄糖作用下(A) p53、(B) p21和 (C) p16的PCR結果(aP＜0.05，bP＜0.01)F ig.4 PCR result of (A) p53, (B) p21 and (C) p16 with different concentrations of glucose (aP＜0.05，bP＜0.01)