崔少遠(yuǎn)，傅 博，王 旭，陳香美

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 腎臟病科，腎臟疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100853

蛋白尿是原發(fā)性腎小球疾病基本的臨床表現(xiàn)，也是慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其通過(guò)改變腎小球血流動(dòng)力學(xué)、損傷腎小球毛細(xì)血管壁及系膜細(xì)胞等造成腎小球硬化，大量蛋白尿的持續(xù)存使腎損傷進(jìn)行性加重，最終導(dǎo)致終末期腎病[1]。降低蛋白尿是治療腎病的關(guān)鍵，對(duì)早期防治CKD具有重要意義。

目前認(rèn)為蛋白尿發(fā)生的主要原因是腎小球?yàn)V過(guò)屏障結(jié)構(gòu)和功能改變，腎小球?yàn)V過(guò)屏障主要由足細(xì)胞及足細(xì)胞足突裂隙膜(slit diaphragm，SD)組成，足突附著在腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)的腎小球毛細(xì)血管上，形成細(xì)胞間連接，從而產(chǎn)生隔膜濾過(guò)屏障，幫助維持正常腎功能[2]；足細(xì)胞損傷后足突消失、細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)屏障破壞，是局灶節(jié)段性腎小球硬化、微小病變腎病以及糖尿病腎病等疾病患者發(fā)生蛋白尿的關(guān)鍵因素[3]。足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白Nephrin、NEPH1、P-cadherin、FAT、ephrin-B1、TRPC6等關(guān)鍵分子組成SD復(fù)合物，細(xì)胞骨架協(xié)同蛋白Synaptopodin、ZO-1、Podocin、CD2AP、MAGI等連接裂隙膜與細(xì)胞骨架，這些蛋白調(diào)節(jié)足細(xì)胞骨架維持足突的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，使其行使正常的濾過(guò)功能[4-5]。而在一些有害因素的刺激下，足細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可持續(xù)性升高，即鈣超載，鈣超載會(huì)對(duì)足細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷，使足細(xì)胞凋亡、分離，足突結(jié)構(gòu)改變及數(shù)量減少，破壞腎小球結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)平衡，改變腎小球?yàn)V過(guò)系數(shù)，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生[6]。

Ca2+是機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)不可缺少的離子，作為第二信使參與多條信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用，維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)主要指維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)、質(zhì)膜鈣泵及鈣離子通道的鈣穩(wěn)態(tài)[7]。NCX1作為調(diào)控Ca2+的重要通道，是廣泛分布于膜結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞質(zhì)膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等)的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，功能上具有兩種轉(zhuǎn)運(yùn)模式：介導(dǎo)Na+內(nèi)流、Ca2+外排的前向模式(forward mode)和作用相反的反向模式(reverse mode)[8]。在有害因素刺激下，NCX1反向模式的異常激活導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高，形成鈣超載，啟動(dòng)下游鈣離子信號(hào)通路，導(dǎo)致病理反應(yīng)[9-10]。

本研究建立被動(dòng)型海曼腎炎(passive Heymann nephritis，PHN)大鼠模型，探討鈉鈣交換蛋白1(sodium-calcium exchanger 1，NCX1)與蛋白尿的關(guān)系；體外培養(yǎng)足細(xì)胞，建立補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型，檢測(cè)胞內(nèi)Ca2+變化及下游信號(hào)通路的激活情況，觀察足細(xì)胞骨架蛋白及相關(guān)蛋白的表達(dá)，NCX1反向作用抑制劑KB-R7943能否有效減輕足細(xì)胞損傷，闡明NCX1在足細(xì)胞損傷中的重要 作用和可能機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)；小鼠足細(xì)胞條件永生系MPC-5為美國(guó)Bronx大學(xué)的Dr. Peter Mundel惠贈(zèng)；Ca2+探針Fluo-3、F-actin探針購(gòu)自Thermo Scientific公司，NCX1、Nephrin、Synaptopodin抗體購(gòu)自CST公司，RhoA、ROCK1、ROCK2抗體購(gòu)自Abcam公司，體外毒理學(xué)檢測(cè)試劑盒、C6補(bǔ)體血清及不含C6的補(bǔ)體血清、KB-R7943購(gòu)自S igma-Aldrich公司。

2 建立PHN大鼠模型 近曲腎小管刷狀緣抗原Fx1A提?。?00 ～ 250 g雄性SPF級(jí)SD大鼠25只，3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取腹正中切口，心臟取血后左心室注入0.9%氯化鈉注射液灌洗腎致腎變白，取下腎，低溫下分離腎皮質(zhì)。取無(wú)血的腎皮質(zhì)加入甘露醇-Tris-HCl緩沖液(10 mL/g腎皮質(zhì))，玻璃勻漿器制勻，腎皮質(zhì)勻漿，加入1 mol/L MgCl2至濃度為10 mmol/L，攪拌15 min，2 200 g離心20 min，取上清，100 000 g 4℃離心45 min，收集沉淀，冷凍干燥，?20℃保存，近曲腎小管刷狀緣抗原Fx1A提取已完成。兔抗大鼠Fx1A抗血清制備：雄性新西蘭大白兔4只，體質(zhì)量約2.5 kg，通過(guò)足趾一腘窩淋巴結(jié)一背部皮內(nèi)皮下多點(diǎn)注射混合免疫法免疫兔子，末次注射免疫原后10 d試血。從耳靜脈采血檢測(cè)效價(jià)達(dá)1︰32 000以上時(shí)，頸動(dòng)脈插管放血，分離Fx1A抗血清。使用前56℃滅活補(bǔ)體30 min，大鼠血球吸附，抗血清小量分裝，?20℃保存；雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為兩組，一組經(jīng)腹腔一次性注射蒸餾水，劑量為0.8 mL/100g，另外一組經(jīng)腹腔一次性注射等量兔抗Fx1A抗血清。于第1周末開(kāi)始測(cè)定大鼠24 h尿蛋白定量，金屬代謝籠收集24 h尿液，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿蛋白，當(dāng)24 h尿蛋白定量＞1 0 mg時(shí)認(rèn)為模型建立成功。

3 建立體外補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型 對(duì)照組(Con組)：小鼠足細(xì)胞MPC-5用含Rabbit anti-Fx1A抗體5 mg/mL的無(wú)血清培養(yǎng)液37℃孵育30 min，孵育后用不含C6補(bǔ)體的血清37℃孵育60 min。補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型組(C5b-9組)：小鼠足細(xì)胞MPC-5用含Rabbit anti-Fx1A 抗體5 mg/mL的無(wú)血清培養(yǎng)液37℃孵育30 min，然后用含C6補(bǔ)體的亞溶解劑量的補(bǔ)體血清(稀釋度為8%)的細(xì)胞培養(yǎng)液37℃孵育60 min。Checkerboard titration studies 法確定細(xì)胞亞溶解劑量，體外毒理學(xué)檢測(cè)試劑盒(Sigma-Aldrich)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶的含量確定造模成功。NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(KB-R7943組)：5μmol/L KB-R7943預(yù)處理足細(xì)胞24 h，含Rabbit anti-Fx1A抗體5 mg/mL的無(wú)血清培養(yǎng)液37℃孵育30 min，然后用含亞溶解劑量的補(bǔ)體血清(稀釋度為8%)的細(xì) 胞培養(yǎng)液37℃孵育60 min。

4 胞 內(nèi)Ca2+檢 測(cè) Ca2+探 針Fluo-3 5 μmol/L 37℃避光孵育細(xì)胞30 min，PBS洗滌3次，激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)上機(jī)觀察，掃描圖 像，數(shù)據(jù)分析。

5 免疫熒光檢測(cè) 標(biāo)本置于預(yù)冷的4% 多聚甲醛，4℃ 固定20 min，PBS洗滌3次；0.1%的TritonX-100 4℃透化20 min，PBS洗滌3次；5%BSA室溫封閉20 min，加入一抗4℃孵育過(guò)夜；洗滌，加入二抗，室溫1 h。激光共聚焦顯微鏡( Olympus FV1000)上機(jī)觀察，掃描圖像。

6 Western blot檢測(cè) 裂解標(biāo)本，提取蛋白，變性，電泳分離目標(biāo)蛋白，轉(zhuǎn)膜，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌；二抗室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光儀(美國(guó)UVP)檢測(cè)，拍攝圖像，灰度分析軟件Q uantity One計(jì)算灰度值，統(tǒng)計(jì)分析。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 7軟件進(jìn)行圖表制作及統(tǒng)計(jì)分析。觀測(cè)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以 xˉ ±s表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。

結(jié) 果

1 PHN大鼠模型中NCX1表達(dá)水平的變化 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，PHN模型組大鼠NCX1的表達(dá)水平隨造模時(shí)間逐漸減少，并 在21 d時(shí)達(dá)到最低(圖1)。

2 補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型中NCX1及Ca2+水平的改變 NCX1熒光染色結(jié)果顯示，在補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型組中其表達(dá)降低，應(yīng)用反向模式抑制劑KB-R7943處理后，其表達(dá)明顯增高(圖2A)。Ca2+熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型組的胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高(P＜0.05)；應(yīng)用NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理后，胞內(nèi)Ca2+濃度明顯降低(P＜0.05)(圖2 B和圖2C)。

3 足細(xì)胞損傷模型中Ca2+下游RhoA/ROCK信號(hào)通路分子活性的改變 我們進(jìn)一步用Western blot分析了補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型中Ca2+下游RhoA/ROCK信號(hào)通路分子活性與表達(dá)的改變。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型中活化型RhoA (active RhoA)、ROCK1和ROCK2蛋白的表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05)；應(yīng)用NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理后，可以有效降低這些信號(hào)通路蛋白的活性及表達(dá)水平(P＜0.05)，提示抑制NCX1反向模式可以有效降低RhoA/ROCK信 號(hào)通路的激活(圖3)。

圖 1 免疫熒光染色檢測(cè)PHN大鼠模型中NCX1的表達(dá)(Con組：對(duì)照組；PHN模型組7 d、14 d、21 d、28 d；藍(lán)色：細(xì)胞核)Fig.1 Expression of NCX1 in PHN rat model detected by immunofluorescence staining (Con: control group; PHN model groups for 7 days, 14 days, 21 days, 28 days; Blue: nuclei)

4 NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理有效減輕足細(xì)胞損傷 應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞中細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)與結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞骨架沿細(xì)胞長(zhǎng)軸呈線性分布，骨架結(jié)構(gòu)整齊清晰，足突明顯，熒光強(qiáng)度明亮；補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型組骨架蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低，足細(xì)胞皺縮，骨架結(jié)構(gòu)斷裂，排列紊亂；而KB-R7943處理組骨架蛋白表達(dá)水平恢復(fù)，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)明顯改善，足細(xì)胞損傷明顯減輕(P＜0.05)。足細(xì)胞標(biāo)志物Nephrin蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈顆?；蚓€裝分布。F-actin、Nephrin蛋白、足細(xì)胞骨架協(xié)同蛋白Synaptopodin在三組間的變換趨勢(shì)比較一致，補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；而KB-R7943處理組顯著高于補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型組(P＜0.05)，而與對(duì)照組比較則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)，說(shuō)明足細(xì)胞損傷后三種蛋白表達(dá)均降低，而KBR7943可以逆轉(zhuǎn)這種損傷，使蛋白水平恢復(fù)到正常水 平。

圖 2 補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型中NCX1及Ca2+水平的變化(藍(lán)色：細(xì)胞核)A：足細(xì)胞免疫熒光染色NCX1；B和C：足細(xì)胞Ca2+熒光染色圖像及熒光數(shù)據(jù)分析；Con：對(duì)照組；C5b-9：補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型組；KB-R7943：NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(n=10，C5b-9 vs Con，KB-R7943 vs C5b-9，aP＜0.05)Fig.2 Immunofluorescence staining of NCX1 and intracellular Ca2+ in podocytes (Blue: nuclei)A: Immunofluorescence staining of NCX1; B and C: Fluorescence imaging and quantitative analysis of Ca2+; Con: Control group; C5b-9: Complement injured podocyte model group; KB-R7943: KB-R7943 treatment group (n=10, C5b-9 vs Con, KB-R7943 vs C5b-9,aP＜0.05)

圖 3 Western blot檢測(cè)RhoA/ROCK信號(hào)通路蛋白活性Con：對(duì)照組；C5b-9：補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型組；KB-R7943：NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(n=5，C5b-9 vs Con，KBR7943 vs C5b-9，aP＜0.05)Fig.3 RhoA/ROCK signaling pathway proteins activities detected by Western blot Con: Control group; C5b-9: Complement injured podocyte model group; KB-R7943: KB-R7943 treatment group (n=5, C5b-9 vs Con,KB-R7943 vs C5b-9, aP＜0.05)

討 論

哺乳動(dòng)物的NCX是由同源蛋白的多基因家族形成，包括3個(gè)家族、9個(gè)亞型，分別為非K+依賴(lài)性的NCX1、NCX2、NCX3；K+依 賴(lài)性的NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5；陽(yáng)離子依賴(lài)性的NCKX6和NCLX[11]。NCX1廣泛分布于哺乳動(dòng)物器官和組織，NCX2和NCX3主要表達(dá)于神經(jīng)和骨骼肌中，而腎表達(dá)以NCX1為主[12]。近年來(lái)，各領(lǐng)域?qū)CX1的研究不斷深入，NCX1不僅能夠調(diào)控Ca2+濃度，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性及興奮耦聯(lián)功能[13-15]，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、浸潤(rùn)、遷移等過(guò)程[16-18]。在心臟搏動(dòng)、大腦長(zhǎng)程學(xué)習(xí)效應(yīng)、血壓控制、腎重吸收、免疫應(yīng)答、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、胰島素分泌等方面發(fā)揮重要作用。?

圖 4 足細(xì)胞F-actin、Nephrin和Synaptopodin的表達(dá)與結(jié)構(gòu)改變(藍(lán)色：細(xì)胞核 )A：免疫熒光染色檢測(cè)F-actin、Nephrin和Synaptopodin；B：熒光數(shù)據(jù)分析；Con：對(duì)照組；C5b-9：補(bǔ)體激活足細(xì)胞損傷模型組；KBR7943組：NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(n=12，C5b-9 vs Con，KB-R7943 vs C5b-9，aP＜0.05)Fig.4 Immunofluorescence staining of F-actin, Nephrin and Synaptopodin in podocytes (Blue: nuclei)A: Immunofluorescence imaging of F-actin, Nephrin and Synaptopodin; B: Quantitative analysis of immunofluorescence images; Con:Control group; C5b-9:Complement injured podocyte model group; KB-R7943: KB-R7943 treatment group (n=12, C5b-9 vs Con, KBR7943 vs C5b-9, aP＜0.05)

有報(bào)道NCX1參與腎Ca2+重吸收，與腎缺血再灌注相關(guān)，并誘導(dǎo)腎上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[19-20]。關(guān)于NCX1在腎小球足細(xì)胞中作用的研究較少，已報(bào)道腎小球足細(xì)胞中有NCX1表達(dá)；在嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷研究中發(fā)現(xiàn)NCX1表達(dá)減少，其前向模式受到抑制而激活反向模式，增加了Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+超載，損傷足細(xì)胞[21]。NCX1作為調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+的重要通道，在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架方面發(fā)揮重要作用，其調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的作用依賴(lài)自身Ca2+結(jié)合中心的變構(gòu)激活，與胞內(nèi)Ca2+濃度密切相關(guān)[22]。我們的工作證實(shí)了NCX1通過(guò)調(diào)控鈣離子內(nèi)流激活了RhoA/ROCK信號(hào)通路，從而改變足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，應(yīng)用KB-R7943能有效減輕足細(xì)胞損傷。KBR7943屬于Benzyloxyphenyl衍生物，NCX反向轉(zhuǎn)運(yùn)的選擇性抑制劑，其廣泛應(yīng)用于心血管相關(guān)疾病的研究[23]。KB-R7943可濃度依賴(lài)性地舒張高鉀預(yù)收縮的大鼠離體腎動(dòng)脈環(huán)，為治療腎性高血壓，緩解腎病理?yè)p傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[24]；KBR7943對(duì)缺血再灌注所致的腎功能障礙和組織損傷有保護(hù)作用[25-26]；本研究證實(shí)了其在足細(xì)胞中的保護(hù)作用，這些研究證實(shí)了KB-R7943在腎病治療中的可能性。

NCX1作為膜蛋白，其在細(xì)胞表面不規(guī)則分布，胞內(nèi)呈弱放射線分布，與F-actin張力纖維接觸，而且在細(xì)胞與細(xì)胞連接的區(qū)域呈現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)F-actin亦高表達(dá)，這與相鄰足細(xì)胞連接形成腎小球?yàn)V過(guò)屏障，調(diào)控腎小球?yàn)V過(guò)的作用極其相似；而足細(xì)胞中另外一個(gè)重要的Ca2+通道蛋白TRPC6是腎小球裂隙膜蛋白SD復(fù)合物分子，其與NCX1的復(fù)合物能調(diào)控細(xì)胞遷移，這對(duì)維持腎小球?yàn)V過(guò)作用很重要，NCX1是否也是SD復(fù)合物分子？其與已知的組成裂隙膜的重要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)CD2AP、Podocin等存在何種相互作用？這是我們進(jìn)一步研究的方向，以全面揭示NCX1在足細(xì)胞上的作用機(jī)制，探索蛋白尿產(chǎn)生的新途徑，為臨床防治蛋白尿提供新的思路。