劉 巖，李 泱，葉加虎，劉 昕，王延坤，單兆亮

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院 京北醫(yī)療區(qū)，北京 100091；3 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 心內(nèi)科，北京 100853

近年來(lái)，心房顫動(dòng)(房顫)的全球患病率及其相關(guān)死亡率顯著上升，社會(huì)負(fù)擔(dān)逐年增加，影響著公共健康[1-3]。房顫的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，大量研究表明氧化應(yīng)激與房顫關(guān)系密切[4-6]。夾竹桃麻素(apocynin，APO)是氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中重要的氧化酶抑制劑，其能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激的損傷作用[7-8]。本課題組以往研究表明，APO對(duì)兔心房肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流及超速激活延遲整流鉀電流氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[9]。但APO對(duì)L型鈣電流(L-type calcium current，ICa,L) 和動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration，APD)的氧化應(yīng)激損傷是否有保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們運(yùn)用了膜片鉗技術(shù)，研究APO對(duì)ICa,L和APD氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買新西蘭白兔15只，體質(zhì)量1.0～1.5 kg，雌雄不限。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批 準(zhǔn)(編號(hào)：20110010703)。

2 試劑 夾竹桃麻素、CaCl2、胰蛋白酶、CdCl2、膠原酶Ⅱ購(gòu)自Sigma公司。其他為國(guó)產(chǎn)試劑。臺(tái)式液：葡萄糖10 mmol/L，MgCl21.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，NaCl 135 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，NaOH調(diào)整pH值至7.4[9]。酶液：胰蛋白酶12 mg，Ⅱ型膠原酶70 mg，無(wú)鈣臺(tái)式液50 mL[9]。反轉(zhuǎn)錄及qPCR試劑(北京TransGen公司)，抗CACNA1C小鼠單克隆抗體(ab84814) (Abcam公司，英國(guó))，抗GAPDH小鼠單克隆抗體(TA-08)，其 他試劑均為分析純。

3 兔單個(gè)左心房肌細(xì)胞的分離 按文獻(xiàn)[10-12]方法并加以改進(jìn)制備兔單個(gè)左心房肌細(xì)胞。術(shù)前配制麻藥水合氯醛(200 g/L)。經(jīng)腹腔注射(2 mL/kg)麻藥，徹底麻醉后從胸部剪開(kāi)快速取心臟，隨后在Langendorff裝置上灌流。首先用無(wú)鈣臺(tái)式液灌流3～5 min，隨后再用酶液灌流20～25 min。灌流過(guò)程中維持37℃并通100%純氧。灌流完畢后將左心房組織剪碎入KB液中，同時(shí)邊剪邊吹打。最后將分離細(xì)胞保存于4℃ KB液中，靜止1 h后實(shí) 驗(yàn)。

4 分組及處理 將兔左心房肌細(xì)胞共分為5組：1)對(duì)照組：不做處理，直接實(shí)驗(yàn)；2)10 μmol/L H2O2組：10 μmol/L的H2O2培養(yǎng)30 min后實(shí)驗(yàn)；3)50 μmol/L H2O2組：50 μmol/L的H2O2培 養(yǎng)30 min后實(shí)驗(yàn)；4)50 μmol/L H2O2+ 100 μmol/L APO組：100 μmol/L APO培養(yǎng)60 min，再50 μmol/L H2O2培養(yǎng)30 min后實(shí)驗(yàn)；5)APO組：100 μmol/L A PO培養(yǎng)90 min后實(shí)驗(yàn)。

5 膜片鉗全細(xì)胞L型鈣電流及動(dòng)作電位記錄 挑選無(wú)收縮、狀態(tài)良好、橫紋清晰的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。高阻(＞1 GΩ)封接破膜后，行全細(xì)胞記錄。離子電流信號(hào)經(jīng)AXON-700B膜片鉗放大器、軟件(pCLAMP)控制采集、貯存及分析。電壓鉗模式 行電流記錄。電流鉗模式行動(dòng)作電位記錄。

6 RT-qPCR法 檢 測(cè) 肌 細(xì) 胞L型 鈣 離 子 通道CACNA1C mRNA的表達(dá)水平 每組細(xì)胞分別處理后，應(yīng)用Trizol試劑一步法行心房肌總RNA提取。應(yīng)用兩步法行RT-qPCR反應(yīng)。CACNA1C上游引物5′-GATGCAAGACGCTATGGGCTATGAG-3′，下游引物5′-GCATGCTCATGTTTCGGGGTTT GTC-3′均由上海捷瑞公司設(shè)計(jì)與合成。NanoDrop 2000評(píng)估各樣本的質(zhì)量，A260/A280在1.8～2.1，A260/A230＞1.8為合格。各樣本上樣1 μg，隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以對(duì)照組第一個(gè)樣本為參照樣本，采用 2?ΔΔCt法評(píng)估各組相對(duì)表達(dá)數(shù)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7 Western blot檢測(cè)肌細(xì)胞CaV1.2蛋白的表達(dá)水平 將以上5組細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS兩次漂洗后，用細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)于準(zhǔn)備好的冰塊上裂解30 min；12 000 g離心15 min，行上清液收集；用BCA法測(cè)定濃度后，高溫使蛋白變性，加樣，用5%濃縮膠和8%分離膠跑膠，行濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。抗鼠抗兔CaV1.2單克隆抗體以1∶1 000稀釋，CaVβ2以1∶1 000稀釋，4℃孵育后過(guò)夜，TBST洗膜5 min×3次，Ⅱ抗孵育1.5 h后行3次洗膜，ECL法顯色。行半定量分析(應(yīng)用Image J圖像分析軟件)。用目的蛋白和GAPDH條帶光密度 值的比值表示蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS23.0進(jìn)行研究資料分析。觀測(cè)資料均為計(jì)量數(shù)據(jù)，均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，以±s 表示。兩組間的比較為成組t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)。多組間的比較為單因素方差分析+兩兩比 較LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1 APO對(duì)兔單個(gè)左心房肌細(xì)胞ICa,L的作用 10 μmol/L H2O2組：ICa,L峰值從(?18.5±0.1) pA/pF減至(?10.7±0.7) pA/pF (P＜0.01，n=13)；50 μmol/L H2O2組：ICa,L峰 值 從(?18.5±0.1) pA/pF減 至(?9.4±0.8) pA/pF (P＜0.01，n=13)；50 μmol/L H2O2+100 μmol/L APO組：ICa,L峰值為(?16.7±1.6) pA/pF，與50 μmol/L H2O2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，n=13)；100 μmol/L APO組：ICa,L峰值為(?17.2±1.3) pA/pF，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 。見(jiàn)圖1。

2 APO對(duì)ICa,L電流-電壓曲線的作用 在0 mV時(shí)電流達(dá)峰值，電流-電壓呈現(xiàn)出“倒鐘”型曲線。在H2O2作用下，電流明顯被抑制，電流-電壓接近“三角”型曲線。預(yù)先給予100 μmol/L APO后，電 流抑制得到恢復(fù)。見(jiàn)圖2。

3 APO對(duì)ICa,L穩(wěn)態(tài)激活和穩(wěn)態(tài)失活曲線的作用 在H2O2作用下，激活曲線正移。H2O2(10 μmol/L)組：半激活電壓(V1/2,act)由(?37.5±0.6) mV正移至(?29.3±0.4) mV (P＜0.05)；H2O2(50 μmol/L)組：半激活電壓(V1/2,act)由(?37.5±0.6) mV正移至(?20.3±0.5) mV (P＜0.01)；H2O2(50 μmol/L)+APO (100 μmol/L)組：V1/2,act恢復(fù)至(?29.8±0.3) mV(與50 μmol/L H2O2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05)。提示APO可能通過(guò)增加通道穩(wěn)態(tài)激活來(lái)減少H2O2對(duì)ICa,L電流的影響，各組曲線斜率(k)改變較小(圖3A)。在H2O2作用下，失活曲線負(fù)移。H2O2(10 μmol/L)組：半失活電壓(V1/2,act)由(?19.2±0.7) mV負(fù)移至(?25.5±0.8) mV (P＜0.05)；H2O2(50 μmol/L)組：半激活電壓(V1/2,act)由(?19.2±0.7) mV負(fù) 移 至(?29.3±0.4) mV (P＜0.01)；H2O2(50 μmol/L)+APO (100 μmol/L)組：V1/2,act恢復(fù)至(?25.9±0.7) mV (與50 μmol/L H2O2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05)。提示APO可能通過(guò)減緩?fù)ǖ婪€(wěn)態(tài)失活過(guò)程來(lái)減少H2O2對(duì)ICa,L電流的影響，各 組曲線斜率(k)改變較小(圖3B)。

圖 1 APO對(duì)心房肌細(xì)胞ICa,L的作用(n=13)A：ICa,L電流圖；B：ICa,L最大峰值電流的對(duì)比；aP＜0.01，vs對(duì)照組；bP＜0.01，vs 50 μmol/L H2O2處理組Fig.1 Effect of APO on ICa,Lof atrial myocyte (n=13)A: current of ICa,L; B: contrast of the peak current of ICa,L; aP＜0.01, vs control group; bP＜0.01, vs 50 μmol/L H2O2

圖 2 APO對(duì)ICa,L的電流-電壓曲線的作用(n=13)F ig.2 Effect of APO on the I-V curve of ICa,L (n=13)

4 APO對(duì)ICa,L失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的作用 各組通道電流失活后，通道恢復(fù)曲線基本保持一致。見(jiàn) 圖4。

5 APO對(duì)動(dòng)作電位的作用 在H2O2作用下，動(dòng)作電位形狀發(fā)生變化，RMP絕對(duì)值降低，APD縮短，APD50及APD90均降低(與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05)。應(yīng)用100 μmol/L APO后上述降低得到顯著恢復(fù)，APD50與H2O2處理組比較差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，n=13)。見(jiàn)圖5，表1。

圖 3 APO對(duì)ICa,L穩(wěn)態(tài)激活和穩(wěn)態(tài)失活曲線的作用(n=13)Fig.3 Effect of APO on steady-state activation and steady-state inactivation curve of ICa,L (n=13)

圖 4 APO對(duì)ICa,L失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的作用(n=13)F ig.4 Effect of APO on the recovery from inactivation of ICa,L (n=13)

圖 5 APO對(duì)APD的的作用F ig.5 Effect of APO on APD

6 qPCR法檢測(cè)H2O2對(duì)肌細(xì)胞CACNA1C mRNA表達(dá)的影響及APO的作用 圖6顯示，CACNA1C mRNA表達(dá)：對(duì)照組為1.102±0.050，H2O2組(10 μmol/L)為0.810±0.042，H2O2組(50 μmol/L)為0.790±0.035，APO(100 μmol/L)+ 50 μmol/L H2O2組為1.024±0.080，單純APO組為1.083±0.060。提示APO對(duì)H2O2處理后CACNA1C mRNA表達(dá)下 調(diào)有明顯的抑制效應(yīng)(P＜0.05，n=13)。

7 Western blot 檢測(cè)兔左心房肌細(xì)胞CaV1. 2蛋白的表達(dá) 圖7顯示，H2O2處理后，可以使CaV1.2蛋白表達(dá)下調(diào)，而應(yīng)用APO (100 μmol/L)后，此下 調(diào)得到恢復(fù)(P＜0.05，n=3)。

圖 6 APO對(duì)肌細(xì)胞CACNA1C mRNA表達(dá)的作用(aP＜0.05，vs對(duì)照組 ；bP＜0.05，vs 50 μmol/L H2O2組)Fig.6 Effect of APO on the expression of CACNA1C mRNA (aP＜0.05, vs control group；bP＜0.05, vs 50 μmol/L H2O2)

圖 7 Western blot 檢測(cè)兔左心房肌細(xì)胞CaV1.2蛋白的表達(dá)(aP＜0.05，vs 對(duì)照組；bP＜0.05，vs 50 μmol/L H2O2)Fig.7 Expression of CaV1.2 tested by Western blot (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs 50 μmol/L H2O2)

討 論

房顫是臨床上最常見(jiàn)的心律失常之一，其機(jī)制復(fù)雜，大量研究表明，氧化應(yīng)激是誘發(fā)和維持房顫的重要機(jī)制之一[3,13]。本文用低濃度H2O2(10 μmol/L、50 μmol/L)創(chuàng)建氧化應(yīng)激模型[14]，探討APO對(duì)左心房肌細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。

表 1 H2O2與APO對(duì)體外兔左心房肌細(xì)胞AP各參數(shù)影響指標(biāo)的比較 ( n =13,xˉ±s )Tab. 1 Comparison of the effect of H2O2 and APO on AP parameters ( n =13,xˉ±s )

APO抑制H2O2處理所致的兔左心房肌細(xì)胞ICa,L電流密度降低，分析其門控動(dòng)力學(xué)機(jī)制：APO可能通過(guò)改變左心房肌細(xì)胞L型鈣通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線負(fù)向移動(dòng)，增加通道的激活，與此同時(shí)使其穩(wěn)態(tài)失活曲線正向移動(dòng)，鈣通道的失活過(guò)程減緩，二者聯(lián)合，使同等電壓條件下，增加了鈣離子通道的開(kāi)放數(shù)量，導(dǎo)致電流增加。前期研究表明，H2O2可使左心房肌細(xì)胞中谷胱甘肽的數(shù)量和超氧化物歧化酶的活性下降，并且可增加丙二醛的生成，APO使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶含量增加，并且可以減弱對(duì)多不飽和脂肪酸的攻擊，從而降低氧化應(yīng)激對(duì)左心房肌細(xì)胞的損傷[5]。

進(jìn)一步研究顯示，APO可通過(guò)影響CACNA1C mRNA和CaV1.2通道蛋白的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)左房細(xì)胞鈣通道有效數(shù)量，從而影響ICa,L電流密度。提示我們APO不僅可以直接影響鈣通道門控動(dòng)力學(xué)機(jī)制改變ICa,L，還可通過(guò)調(diào)節(jié)鈣通道基因及蛋白表達(dá)來(lái)改變ICa,L電流密度。眾所周知，L-鈣通道是構(gòu)成心房肌動(dòng)作電位復(fù)極的主要電流，尤其是對(duì)APD50的改變尤為重要[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，APO通過(guò)增加ICa,L電流密度，可以延長(zhǎng)APD，特別是APD50。這對(duì)于阻滯房顫的發(fā)生非常有利，也是減少房顫發(fā)生和維持的細(xì)胞電生理學(xué)基礎(chǔ)。

本研究?jī)H局限于細(xì)胞水平，我們應(yīng)進(jìn)一步在整體動(dòng)物水平進(jìn)行探究，尤其需要觀察APO對(duì)氧化應(yīng)激誘發(fā)房顫的體表心電圖及房顫發(fā)生率的影響。盡管如此，本研究對(duì)于揭示藥物心房肌細(xì)胞電生理和分子機(jī)制仍有一定意義。