趙峻祥，李金庫，王雪洋，劉 晨，孫奉召，李井春，魏國生，李雁冰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

青貯（silage）是在嚴(yán)格密閉的環(huán)境中，使青貯原料發(fā)酵足夠長的時間， 在此期間保持其質(zhì)量相對穩(wěn)定的一種保鮮技術(shù)［1］。 青貯原料應(yīng)選擇易被好氧微生物損壞， 可以在厭氧條件下靠乳酸菌發(fā)酵得以長期保存的原料［2-3］。 營養(yǎng)價值、發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性是鑒定青貯飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)，發(fā)酵品質(zhì)通過pH 值、有機酸含量和微生物菌落數(shù)評定［4］。 大量研究表明，乳酸菌添加劑可以很好地改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)， 使發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量增多，在微生物群落中占據(jù)主導(dǎo)地位，使pH值快速降低，乳酸含量較乙酸含量高［5］。 Kharazian等［6］在玉米青貯飼料中分離出了抗真菌活性高的乳酸菌，可用作青貯飼料添加劑提高青貯品質(zhì)，研究結(jié)果表明， 在青貯飼料中加入同型乳酸菌可以提高發(fā)酵品質(zhì)。 Yuan 等［7］人在青貯飼料中添加同型乳酸菌使得乳酸含量高于對照組。 同型乳酸菌可以提高發(fā)酵品質(zhì)， 但對有氧穩(wěn)定性的提升作用并不顯著，近年來，為了減少有氧穩(wěn)定性差造成的飼料損失， 很多學(xué)者采用異型乳酸菌作為飼料添加劑［8-9］。 也有學(xué)者提出將同型、異型乳酸菌聯(lián)合添加到青貯飼料中，可以在保證發(fā)酵品質(zhì)良好的情況下，提高有氧穩(wěn)定性［10-11］。Parvin 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，向黑麥草和幾內(nèi)亞草中添加乳酸菌可以與附生乳酸菌進行競爭，通過菌落分析，幾乎檢測不到添加的乳酸菌以外的微生物。 基于此，該試驗設(shè)置了添加同型乳酸菌和異型乳酸菌兩個菌種進行青貯，添加的同型乳酸菌為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，PA）， 異型乳酸菌為短乳桿菌（Lactobacillus brevis，LB），研究單一添加和聯(lián)合添加上述2 種菌對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 青貯的調(diào)制與貯存

選用乳熟期全株玉米和開花期黑麥草， 全株玉米經(jīng)鍘草機切碎至1～2 cm 直接青貯，黑麥草青貯前預(yù)干4～8 h 至干物質(zhì)含量為30%～50%，再經(jīng)鍘草機切碎至1～2 cm 后青貯。 試驗設(shè)置4 個組：添加自來水處理組，記為對照組；添加乳酸片球菌處理組，記為PA 組；添加短乳桿菌處理組，記為LB 組； 乳酸片球菌和短乳桿菌聯(lián)合添加處理組，記為PA+LB 組。 將乳酸片球菌和短乳桿菌凍干粉末用自來水溶解稀釋，以2 mL/kg 的劑量均勻噴灑在原材料上，以保證每克原料上的乳酸菌達到106CFU，對照組添加自來水2 mL/kg。 將處理好的原料300 g 放入0.05 mm 厚的塑料袋（27 mm×39 mm），利用真空封口機抽氣封口，置于恒溫環(huán)境（25 ℃）中發(fā)酵，保存在25 ℃恒溫室內(nèi)，貯存30 d。 每個處理3 個平行樣本。 乳酸片球菌和短乳桿菌分離于發(fā)酵TMR。

1.2 化學(xué)成分及微生物菌落數(shù)分析

1.2.1 干物質(zhì)含量測定DM 測定： 采用60 ℃，48 h 干燥法。

1.2.2 樣品處理在30 d 開袋時取樣，稱取樣品20 g， 放入實驗用樣品袋， 加180 mL 無菌生理鹽水，密封，在搖床上以120 r/min 搖動10 min。 用3層無菌紗布過濾青貯草渣， 濾液用于青貯飼料的乙醇、乳酸、短鏈脂肪酸含量和pH 值的測定。

1.2.3 pH 值測定用梅特勒Ps-2 型酸度儀測定pH 值。

1.2.4 有機酸含量測定有機酸含量采用液相色譜法測定：將青貯濾液經(jīng)0.20 μm 的過濾器過濾，取10 μL 過濾后的濾液加入色譜柱。 色譜條件為：色 譜 柱 ICSep COREGEL -87H column （Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan）（8 μm，7.8 mm×100 mm）； 流動相0.004 mol/L 硫酸, 臨用前用超聲波脫氣；流速0.6 mL/min；進樣20 μL；溫度60 ℃。

1.2.5 微生物菌落數(shù)分析乳酸菌的培養(yǎng)采用MRS 培養(yǎng)基， 酵母菌的培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。 微生物菌落數(shù)采用微生物平板菌落計數(shù)法獲得。

1.3 有氧穩(wěn)定性試驗

所有青貯飼料達到貯存日期后開封， 取出150 g 樣本，放入500 mL 的無菌廣口瓶，樣本正中插入溫度計，并敞口放置7 d，環(huán)境溫度為25 ℃恒溫。 每日2 次（6：00 和18：00）記錄室溫和所有樣本的溫度， 當(dāng)樣本的溫度超過室溫2 ℃時判定為樣本腐敗。 7 d 后檢測pH 值和發(fā)酵產(chǎn)物，pH 值上升幅度小,有氧穩(wěn)定性較好,反之則較差。

1.4 統(tǒng)計分析

利用IBM SPSS Statistics 19 軟件方差分析中的Duncan′s 方法進行多重比較，判斷數(shù)值間的差異性，P＜0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 全株玉米貯藏30 d 后的有機成分和微生物組成

由表1 可知，在青貯玉米貯藏30 d 后，各組pH 值均低于4.0。 各組乳酸含量無顯著差異（P＞0.05）；LB 組和PA+LB 組乙酸值顯著 （P＜0.05）高于其他組， 乙酸可以抑制青貯飼料中好氧微生物的活性，提高飼料的有氧穩(wěn)定性，同時乙酸含量高會影響飼料的適口性；對照組和LB 組的乙醇含量顯著（P＜0.05）高于PA 組和PA+LB 組，乙醇含量高會對青貯飼料的營養(yǎng)價值有一些不良影響；添加乳酸菌的3 個組乳酸菌數(shù)量顯著（P＜0.05）高于對照組；LB 組和PA+LB 組酵母菌數(shù)量低于對照組和PA 組（P＜0.05），酵母菌數(shù)量高不利于改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。

2.2 乳酸菌對青貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響

通過有氧穩(wěn)定性試驗可知（見表2），對照組在開封后1 d 腐敗，PA 組和LB 組分別在2 d 和2.5 d 腐敗；PA+LB 組5 d 后腐敗， 與其他組相比延后。

經(jīng)過7 d 有氧穩(wěn)定性試驗， 與表1 中對應(yīng)的各個指標(biāo)比較，各組pH 值顯著（P＜0.05）增加；各組乳酸、乙酸和乙醇含量明顯降低（P＜0.05）。 由表3 可知，PA+LB 組pH 值顯著（P＜0.05）低于其他各組，乳酸含量顯著（P＜0.05）高于其他各組；乳酸菌和酵母菌數(shù)量各組無顯著差異（P＞0.05）。

表1 全株玉米貯藏30 d 后青貯飼料成分分析

表2 各組玉米青貯飼料有氧穩(wěn)定性分析 單位：d

表3 有氧穩(wěn)定性試驗后的青貯玉米飼料成分分析

表4 黑麥草貯藏30 d 后青貯飼料成分分析

2.3 黑麥草貯藏30 d 后的有機成分和微生物組成

由表4 可知，對照組pH 值顯著（P＜0.05）高于其他各組；PA 組乳酸含量顯著（P＜0.05）高于其他各組；LB 組和PA+LB 組乙酸含量高于其他各組；PA 組乙醇含量顯著（P＜0.05）低于其他各組；LB 組和PA+LB 組未檢測到酵母菌，乳酸菌數(shù)量低于對照組和PA 組（P＜0.05）。

2.4 乳酸菌對青貯黑麥草有氧穩(wěn)定性的影響

由表5 可知， 對照組青貯飼料在2 d 后發(fā)生腐敗； 添加乳酸菌的各試驗組青貯飼料的有氧穩(wěn)定性都大于7 d，有氧穩(wěn)定性好。

經(jīng)過7 d 有氧穩(wěn)定性試驗，與表4 比較，對照組pH 值因為腐敗而增加（P＜0.05），乳酸含量升高（P＜0.05），乙醇含量降低（P＜0.05）；添加乳酸菌的各組pH 值無明顯變化，乳酸含量增加（P＜0.05），乙醇含量降低（P＜0.05）。 由表6 可知，添加乳酸菌的各組pH 值顯著（P＜0.05）低于對照組，乳酸含量顯著 （P＜0.05） 高于對照組；LB 組乙酸含量顯著（P＜0.05）高于其他各組，可能是由于LB 為異型乳酸菌，主要產(chǎn)物為乙酸；乳酸菌數(shù)量各組無顯著差異（P＞0.05）；對照組酵母菌數(shù)量顯著（P＜0.05）高于PA 組，LB 組和PA+LB 組未檢測到酵母菌。

表5 各組黑麥草青貯飼料有氧穩(wěn)定性分析 單位：d

3 討論

3.1 乳酸菌添加劑對青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響

該試驗中， 全株玉米發(fā)酵30 d 后各組pH 值都低于4.0，青貯效果良好；各添加乳酸菌的試驗組乳酸菌數(shù)量顯著高于對照組；PA 組和聯(lián)合添加組乙醇含量顯著低于LB 組和對照組，主要原因是由于PA 屬于同型乳酸菌， 可以顯著降低乙醇含量。各組乳酸含量無顯著差異，乳酸含量是決定青貯飼料品質(zhì)的重要因素［13］，該結(jié)果說明乳酸菌添加劑對青貯玉米品質(zhì)的提升無顯著作用， 這可能是因為玉米自身的可溶性糖（WSC）含量高，為乳酸菌提供充足的發(fā)酵底物，可以產(chǎn)生大量乳酸，即使不使用乳酸菌添加劑， 也可以保證產(chǎn)出足夠多的乳酸［14］。PA 組乙酸含量和酵母菌數(shù)量都與對照組無顯著差異， 主要是由于同型乳酸菌主要產(chǎn)物為乳酸，產(chǎn)生可以抑制酵母菌的短鏈脂肪酸很少。LB 組的乙酸含量顯著高于對照組，酵母菌數(shù)量顯著低于對照組， 這是因為異型乳酸菌主產(chǎn)物為乙酸，乙酸可以抑制酵母菌的生長，對提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性有一定幫助［15］，但乙酸含量高會降低飼料的適口性。 在有氧穩(wěn)定性試驗中，PA 組在2 d后就出現(xiàn)腐敗， 這是因為同型乳酸菌產(chǎn)生的乙酸較少，不能很好地抑制酵母菌和霉菌，與Muck［16］和Conaghan 等［17］的報道一致；LB 組在2.5 d 后pH 值上升，出現(xiàn)腐敗，說明通過在青貯玉米中單獨添加異型乳酸菌提高飼料有氧穩(wěn)定性結(jié)果并不理想。 很多研究表明同型乳酸菌降低了青貯飼料的有氧穩(wěn)定性， 但與異型乳酸菌聯(lián)合作用時則改善了青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。 張濤等［18］研究表明在苜蓿中添加青貯菌劑，有效提高了有氧穩(wěn)定性。魏日華［19］研究表明，在無芒燕麥中添加不同乳酸菌對于青貯有氧穩(wěn)定性的提高有明顯作用。 上述試驗受菌種搭配和原料影響， 對于提高青貯的有氧穩(wěn)定性效果不同，但結(jié)果類似。該試驗中青貯玉米聯(lián)合添加組在5 d 后才腐敗， 乳酸含量顯著高于其他各組，這是因為乙酸在前期被消耗，為乳酸菌提供了充足的發(fā)酵底物，有氧暴露后，乳酸含量仍然升高，且pH 值低于4.5，有氧穩(wěn)定性優(yōu)于其他添加組，說明PA 和LB 聯(lián)合添加對青貯玉米有氧穩(wěn)定性有一定的改善作用。

3.2 乳酸菌添加劑對青貯黑麥草發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響

該試驗中的青貯黑麥草在發(fā)酵30 d 后，添加乳酸菌的各組pH 值與對照組相比都顯著降低，說明在黑麥草中添加乳酸菌對于降低pH 值有顯著作用。 添加同型乳酸菌PA 的PA 組，乳酸菌和酵母菌與對照組差異不顯著； 乳酸含量為各組中最高，乙醇含量為各組中最低；乙酸含量低于其他乳酸菌添加組，可以增加青貯飼料的適口性。 PA 單獨添加和聯(lián)合添加對于黑麥草發(fā)酵品質(zhì)都有一定的改善作用。 在有氧穩(wěn)定性試驗中，PA 組、LB 組和PA+LB 組的黑麥草都在7 d 后才出現(xiàn)腐敗，且各組pH 值顯著低于對照組，在青貯黑麥草中單獨添加PA，也可使有氧穩(wěn)定性增強，但在青貯玉米中并沒有顯效， 可能與青貯原料不同或是原料自身附著的微生物不同有關(guān)； 在黑麥草有氧穩(wěn)定性試驗中，PA 組有氧穩(wěn)定性同LB 組、PA+LB 組無差別，但仍能檢測出酵母菌，其抑制腐敗能力不如LB 組和PA+LB 組強大；在有氧穩(wěn)定性試驗后，LB組乙酸含量顯著高于其他各組， 乙酸過高導(dǎo)致飼料適口性降低，影響動物生產(chǎn)力，這也是異型乳酸菌的弱點；而PA+LB 組，在有氧穩(wěn)定性試驗后，抑制腐敗的能力與LB 組類似，但乙酸含量顯著低于LB 組，乳酸含量高于PA 組，說明兩種乳酸菌聯(lián)合添加時具有協(xié)同作用， 在保證具有較高乳酸含量的同時還能提高有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

乳酸片球菌和短乳桿菌聯(lián)合添加對青貯玉米的有氧穩(wěn)定性具有一定的改善作用； 單獨添加乳酸片球菌對青貯黑麥草發(fā)酵品質(zhì)的改善效果最優(yōu)； 向青貯黑麥草中聯(lián)合添加乳酸片球菌和短乳桿菌既可以保證良好的氧穩(wěn)定性， 還能改善飼料發(fā)酵品質(zhì)。