宋 潔，王麗芳，姚一萍，史 培，鐘華晨，郭晨陽，張欣昕，黃 潔

［1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（呼和浩特） 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018］

色氨酸（tryptophan） 是一種功能性必需氨基酸，分為D-型、L-型和DL-型3 種同分異構(gòu)體，天然存在且易被動(dòng)物代謝吸收的為L-型［1］。 L-色氨酸是除酪氨酸和蛋氨酸之外的三大氨基酸飼料添加劑之一，不僅能參與蛋白質(zhì)的生物合成，而且是5-羥色胺、褪黑素、色胺、煙酸等典型生理活性物質(zhì)的生化前體，具有促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育、提高免疫力、改善肉品質(zhì)等作用［2-4］。 由于動(dòng)物自身不能合成色氨酸，必須從飼料中攝取，飼料中色氨酸含量的準(zhǔn)確測定， 對于動(dòng)物體內(nèi)色氨酸平衡及正常新陳代謝至關(guān)重要［5-6］。

目前，色氨酸的測定主要通過常規(guī)堿水解，結(jié)合高效液相色譜或分光光度法。 然而常規(guī)堿水解耗時(shí)過長，色氨酸會被輕微破壞，烘箱溫度也不易控制［7］。 此外，液相色譜法存在出峰較慢、分析時(shí)間長、檢測靈敏度低等問題。分光光度法易受顏色深淺或雜質(zhì)干擾，影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性［8］。 近年來，微波技術(shù)因其反應(yīng)快、能耗低、易操作等優(yōu)勢日益受到關(guān)注。采用微波堿水解法水解樣品，不但可以避免常規(guī)堿水解的缺點(diǎn)， 而且易于控制堿水解條件，結(jié)合全自動(dòng)氨基酸分析儀上機(jī)測定，兩者均具有安全、省時(shí)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。 氨基酸含量測定主要受水解時(shí)間、 水解溫度及水解液濃度等因素影響［9］，因此，該研究利用微波消解儀篩選出微波堿水解的最佳堿濃度、水解溫度和水解時(shí)間，并聯(lián)合氨基酸自動(dòng)分析儀快速測定飼料中色氨酸含量， 建立的方法適用于大規(guī)模飼料樣品中色氨酸的高效、準(zhǔn)確測定，對于飼料營養(yǎng)品質(zhì)評定工作具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（L-Trp，純度≥99%），美國Sigma 公司；甲醇（色譜純），北京迪馬科技公司；氫氧化鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；鹽酸（優(yōu)級純），成都市科隆化學(xué)品有限公司。飼料樣品為奶牛全混合日糧（TMR），購自內(nèi)蒙古當(dāng)?shù)仫暳鲜袌觥?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Mars240/50 微波消解儀 （美國CEM 公司）；S433D 氨基酸自動(dòng)分析儀 （德國Sykam 公司）；XS105 萬分之一天平 （瑞士Mettlr Toledo 公司）；ED115 干燥箱（德國Binder 公司）；Milli-QA10 超純水儀（美國Millipore 公司）；TGL-20M 臺式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液： 精確稱取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品20.4 mg，加適量水和數(shù)滴0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶解，用水定容至100 mL，濃度為1.0 μmol/mL，4 ℃冷藏保存，有效期1 個(gè)月。

L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取1.0 mL 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液置于10.0 mL 容量瓶， 用水稀釋至刻度，濃度為0.1 μmol/mL，即為色氨酸標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)液，4 ℃冷藏保存，有效期2 周。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 單因素試驗(yàn)在微波消解功率1 200 W、升溫10 min、NaOH 為堿解劑條件下，選取水解溫度140、150、160、170、180 ℃，水解時(shí)間10、20、30、40 min，堿濃度3、4、5、6 mol/L 分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究這3 個(gè)因素對色氨酸含量測定結(jié)果的影響。

1.4.2 正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果， 以水解溫度、水解時(shí)間、堿濃度為研究對象，采用L9（34）正交表，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，開展9 次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)（見表1）。

表1 微波水解條件篩選正交試驗(yàn)因素水平表

1.4.3 樣品處理對于脂肪含量小于4%的樣品，準(zhǔn)確稱取0.050 0～0.100 0 mg （精確至0.000 1 g），置于聚四氟乙烯消解管中， 加5 mL 氫氧化鈉溶液，充氮?dú)? min，根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)條件選擇堿濃度、水解溫度和水解時(shí)間進(jìn)行微波水解。取出消解管，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶，用6 mol/L 鹽酸中和，調(diào)pH 值至中性，并用水定容，10 000 r/min 離心10 min， 用0.45 μm 濾器過濾后上機(jī)測定。對于脂肪含量大于4%的樣品，需要先經(jīng)過脫脂處理再按上述步驟進(jìn)行色氨酸含量測定。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0 軟件GLM 方法進(jìn)行方差分析，并用Duncan′s 法［1］進(jìn)行多重比較，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 色氨酸含量測定單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波水解溫度對色氨酸含量測定的影響采用5 mol/L 氫氧化鈉溶液作為水解液，水解時(shí)間30 min，研究140、150、160、170、180 ℃水解溫度對色氨酸含量的影響。 結(jié)果表明， 隨著測定溫度從140 ℃升高至180 ℃，色氨酸含量逐漸增加（見圖1），當(dāng)水解溫度≥160 ℃時(shí)，TMR 色氨酸含量均顯著（P≤0.05）高于140 ℃時(shí)測定結(jié)果。 雖然水解溫度升至180 ℃后TMR 色氨酸含量仍有一定增加，但增幅明顯下降， 且由于溫度過高容易導(dǎo)致堿液過沸損失及水解管爆裂， 選擇170 ℃為色氨酸測定最佳水解溫度。

2.1.2 微波水解時(shí)間對色氨酸含量測定的影響如圖2 所示，在以5 mol/L 氫氧化鈉溶液作為水解液，提取溫度170 ℃條件下，水解時(shí)間在10～30 min時(shí)，色氨酸含量迅速升高，水解效率增加，30 min時(shí)TMR 色氨酸含量均顯著（P≤0.05）高于其他各時(shí)間點(diǎn)，40 min 時(shí)色氨酸含量逐漸降低，表明色氨酸在微波照射時(shí)間延長后可能發(fā)生部分分解［10］。選擇30 min 為最佳水解時(shí)間。

2.1.3 微波水解堿濃度對色氨酸含量測定的影響在水解溫度170 ℃，水解時(shí)間30 min 條件下，分別選取3、4、5、6 mol/L 的氫氧化鈉作為水解液，不同堿濃度對色氨酸含量的影響見圖3。 隨著堿濃度的增大，色氨酸含量增加，當(dāng)堿濃度為5 mol/L 時(shí)，色氨酸的含量達(dá)到最大值， 繼續(xù)增加堿濃度時(shí)，TMR 色氨酸含量顯著（P≤0.05）降低。由此確定水解液最佳堿濃度為5 mol/L。

2.2 色氨酸含量測定正交試驗(yàn)結(jié)果

圖1 微波水解溫度對飼料色氨酸含量測定的影響

圖2 微波水解時(shí)間對飼料色氨酸含量測定的影響

2.2.1 色氨酸含量測定正交試驗(yàn)極差R 值結(jié)果正交試驗(yàn)極差R 值結(jié)果見表2。 影響TMR 色氨酸含量的各因素主次順序?yàn)锳＞C＞B，說明水解溫度對TMR 色氨酸含量影響最大，與Zhang 等［11］認(rèn)為水解溫度對氨基酸水解效率影響最大的研究結(jié)果一致。 色氨酸含量測定最優(yōu)組合為A3B2C3，即水解溫度170 ℃、水解時(shí)間30 min、堿濃度5 mol/L 效果最佳。

2.2.2 色氨酸含量測定正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3。 水解溫度、水解時(shí)間、堿濃度3 個(gè)因素對TMR 色氨酸含量的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。 通過對比偏差平方和、均方可知，A 因素（水解溫度）是影響飼料色氨酸含量測定最主要的因素，與“2.2.1”項(xiàng)下極差R 值分析結(jié)果一致。

2.3 色譜條件

氨基酸自動(dòng)分析儀最佳工作條件：色譜柱為水解氨基酸分析柱LCAK06/Na （4.6 mm×150 mm）；檢測器：570 nm 波長檢測器；流動(dòng)相：檸檬酸鈉A 0.12 mol/L，pH 值3.45， 檸檬酸鈉B 0.2 mol/L，pH值10.85；流動(dòng)相流速：0.45 mL/min；茚三酮流速：0.25 mL/min；柱溫：74 ℃；反應(yīng)器溫度：130 ℃；進(jìn)樣體積：50 μL。色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖見圖4和圖5。

2.4 線性關(guān)系及定量限

采用色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（C=1.00 μmol/mL）進(jìn)行校準(zhǔn)曲線繪制。選取色氨酸含量分別為0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、0.600 mol/mL 的8個(gè)濃度點(diǎn)，以色氨酸含量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制工作曲線（見圖6）。 色氨酸的線性方程為Y=76 138.854 3X， 相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，完全符合實(shí)驗(yàn)室要求。 結(jié)果表明： 色氨酸在0.025～0.600 μmol/mL 濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好。 以10 倍噪音水平對應(yīng)濃度確定定量限，該方法定量限為0.05%。

圖3 氫氧化鈉溶液濃度對飼料色氨酸含量的影響

表2 TMR 色氨酸含量測定正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 TMR 色氨酸含量測定正交試驗(yàn)方差分析

圖4 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

表4 飼料色氨酸含量精密度測定結(jié)果 單位：%

圖5 飼料樣品色氨酸色譜圖

圖6 飼料色氨酸含量線性關(guān)系圖

2.5 精密度

對TMR 飼料進(jìn)行樣品前處理后，在相同條件下平行進(jìn)樣6 次， 精密度試驗(yàn)平均值為0.14%，RSD 為3.58%，詳細(xì)結(jié)果見表4。 這表明該試驗(yàn)精密度良好，能夠準(zhǔn)確測量色氨酸含量。

2.6 回收率

加標(biāo)回收率結(jié)果見表5，TMR 色氨酸回收率93%～104%，平均值為98%。

2.7 方法對比

由表6 可知，微波堿水解法與國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中色氨酸的測定》（GB/T 15400—2018） 中的常規(guī)堿水解法相比具有相近的回收率， 且經(jīng)過t 檢驗(yàn)比較， 兩種方法測定色氨酸含量結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），表明微波堿水解法同樣準(zhǔn)確有效。

3 討論

3.1 微波水解條件選擇

水解是色氨酸含量分析的關(guān)鍵步驟， 水解質(zhì)量的好壞直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性［12］。 色氨酸在酸性條件下不穩(wěn)定、易分解，在使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測定時(shí)， 無法通過酸水解與其他氨基酸同步測出含量，一般通過堿性水解單獨(dú)測定［13］。然而， 已有的國家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)中色氨酸的水解方法多為常規(guī)堿水解法， 色氨酸微波堿水解法研究較少，水解溫度、水解時(shí)間及NaOH 濃度等微波水解條件變動(dòng)范圍較大，且多為單因素試驗(yàn)，并未采用正交試驗(yàn)進(jìn)行科學(xué)優(yōu)化組合［14-16］。 水解溫度低保證了色氨酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，但耗時(shí)過長；水解溫度過高能大大縮短檢測時(shí)間， 但色氨酸結(jié)構(gòu)會被破壞。因此，該試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，篩選出5 mol/L NaOH、170 ℃、水解30 min 作為測定TMR 飼料樣品色氨酸含量的最佳微波堿水解條件，線性關(guān)系良好，色氨酸回收率為93%～104%，精密度RSD 為3.58%，表明色氨酸檢測結(jié)果準(zhǔn)確，并未受到溫度的影響。

3.2 微波堿水解法與常規(guī)堿水解法比較

采用國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中色氨酸的測定》（GB/T 15400—2018）中的常規(guī)堿水解法，使蛋白質(zhì)在堿的作用下，充氮?dú)饷芊?，放?10 ℃恒溫干燥箱，水解20 h 后形成單一色氨酸，該過程步驟繁瑣、耗時(shí)長、勞動(dòng)強(qiáng)度大且處理過程中色氨酸易損失［17］。微波水解的過程： 樣品水解液在超高頻電磁波作用下［18］，極性分子隨微波頻率快速變換取向，分子之間高速碰撞摩擦［19-20］，在密閉環(huán)境中迅速加熱水解，不但克服了常規(guī)水解法缺陷，而且氨基酸的化學(xué)形式不變［21-22］，提高了反應(yīng)速度和靈敏度。 該加熱方式與傳統(tǒng)的加熱方式相比具有操作簡單、樣品水解快、節(jié)約能源、工作效率高和勞動(dòng)強(qiáng)度小等優(yōu)點(diǎn)［23-24］。 因此，研究微波堿水解法快速測定飼料色氨酸含量，有助于提高檢測效率。

表5 飼料色氨酸回收率測定結(jié)果

表6 微波堿水解法與國標(biāo)常規(guī)堿水解法TMR 色氨酸含量對比

4 結(jié)論

①測定飼料中色氨酸含量的最佳微波堿水解條件：水解溫度170 ℃，水解時(shí)間30 min，堿濃度5 mol/L； 水解溫度是影響飼料色氨酸含量的最主要因素。

②結(jié)合氨基酸自動(dòng)分析儀鈉離子流動(dòng)相系統(tǒng)測定TMR 飼料中色氨酸含量為0.14%。 該方法線性關(guān)系良好，方法回收率和樣品精密度較高。