吳琳琳，劉朝陽(yáng)，田茂生，張明全，趙娜，高記華

1 河北中醫(yī)學(xué)院 河北石家莊 050091

2 河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肛腸科 河北石家莊 050011

痔是人類(lèi)特有的一種肛腸疾病，常有“十人九痔、十女十痔”等說(shuō)法，近年來(lái)，隨著人們飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣、人口老齡化等的改變，痔病愈發(fā)成為人們的常見(jiàn)病、多發(fā)病，其在急性發(fā)作期間可出現(xiàn)大量出血、嵌頓、疼痛等癥狀，嚴(yán)重影響人們的健康和生活質(zhì)量[1-2]。關(guān)于痔的病因及發(fā)病機(jī)制先后有肛墊下移學(xué)說(shuō)[3]、靜脈曲張學(xué)說(shuō)[4]、血管增生學(xué)說(shuō)[5]等，但尚未取得一致結(jié)論。目前多認(rèn)為痔組織主要由受損后異常擴(kuò)張的靜脈血管組成，靜脈內(nèi)常見(jiàn)血栓形成，此外還常伴有炎性改變（如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)）、水腫和充血等，造成肛腸黏膜損傷，表面可見(jiàn)潰瘍形成[6-7]。一項(xiàng)關(guān)于痔組織病理分析的研究結(jié)果顯示，痔組織主要的病理改變有：炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、增生性病變、血栓形成和黏膜水腫、糜爛、潰瘍等[8]。目前，臨床對(duì)輕度痔病一般多采用保守療法，對(duì)于已發(fā)展為Ⅲ度、Ⅳ度的痔病，多采取手術(shù)治療[9]。

目前，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有成熟的痔肛腸黏膜損傷動(dòng)物模型，探索建立痔模型的相關(guān)方法主要有將化學(xué)刺激物、致炎劑、抗凝血藥物等注射或涂于肛內(nèi)外、肛周，導(dǎo)致局部發(fā)生感染和炎性反應(yīng)；或采用手術(shù)結(jié)扎直腸、會(huì)陰部靜脈造成黏膜缺血壞死等[10-11]。要進(jìn)一步研究痔病因及發(fā)生機(jī)制，制作出與人類(lèi)痔病病理變化相近的動(dòng)物模型是關(guān)鍵的一步。本研究采用醋酸造模，主要是通過(guò)醋酸的化學(xué)刺激造成肛腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)破壞，通過(guò)激活環(huán)氧合酶和脂氧合酶途徑啟動(dòng)炎性反應(yīng)[12]，進(jìn)一步形成肛腸黏膜的損傷。本研究旨在通過(guò)創(chuàng)新優(yōu)化痔肛腸黏膜損傷模型的建立，提高動(dòng)物模型與人類(lèi)痔病理特點(diǎn)的契合度，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試劑：10%醋酸溶液（取醋酸液5 mL與注射用水45 mL混合均勻）、2%異氟烷（批號(hào)：2017171101，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）、75%酒精（批號(hào)：191014，無(wú)錫華澳藥業(yè)有限責(zé)任公司）、注射用水。

儀器：多通道動(dòng)物麻醉系統(tǒng)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）、FA-N型電子天平（上海力辰邦西儀器科技有限公司）、Leica ASP300S型全自動(dòng)脫水機(jī)（德國(guó)LEICA公司）、Leica RM2245型半自動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）、Leica TS5015型全自動(dòng)染色機(jī)（德國(guó)LEICA公司）、Olympus BX45型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、DP72型圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）、HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州智博瑞儀器制造有限公司）、D610型數(shù)碼相機(jī)（尼康映像儀器銷(xiāo)售有限公司）。外科手術(shù)器械、1 mL注射器、2 mL注射器、濾紙、棉簽、比例尺。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，6～8周齡，重量（200±20）g，由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，使用許可證：SYXK（蘇）2016-0042。大鼠在環(huán)境溫度為（22±2）℃，濕度40%～70%，晝夜12 h/12 h明暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正常飲食并觀察正常生長(zhǎng)活動(dòng)和健康狀況。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與造模 選取SPF級(jí)SD大鼠40只，按重量隨機(jī)分為4組，分別標(biāo)記為空白對(duì)照組、D3組、D7組、單次造模組，每組各10只，各組具體造模方法和步驟如下：用2%異氟烷使大鼠吸入麻醉，取仰臥位，擠出直腸末端糞便；用75%酒精棉球消毒肛門(mén)外周皮膚；將棉簽在10%醋酸溶液中浸泡至少3 s達(dá)到飽和狀態(tài)，取出后在濾紙上吸附掉棉簽過(guò)飽和的溶液，插入大鼠肛門(mén)內(nèi)0.5 cm，保持10 s，棉簽取出后在肛周均勻涂抹一圈。各組內(nèi)每只大鼠操作方法相同，單次造模組只操作1次；D3組、D7組每天操作一次，連續(xù)3天；空白對(duì)照組給予浸泡注射用水的棉簽處理，連續(xù)操作3天。

1.3.2 標(biāo)本制備 造模第3天操作后6 h，D3組、單次造模組動(dòng)物采取頸椎脫臼法處死，剩余兩組大鼠暫不做處理。造模第7天，處死D7組和空白對(duì)照組大鼠。大鼠處死后沿肛周皮毛邊緣約0.3 cm處環(huán)形分離肛門(mén)，深至直腸1.0 cm以上，剪斷腸管移出標(biāo)本。由同一人剪取肛腸組織0.8 cm，縱剖腸管，平鋪腸管后拍照。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）取材后對(duì)直腸進(jìn)行大體形態(tài)觀察，觀察黏膜有無(wú)出血、水腫、潰瘍。

（2）拍照后，稱(chēng)量濕重，測(cè)量肛腸系數(shù)：肛腸系數(shù)（%）=肛腸濕重/動(dòng)物體重×100%。

（3）病理形態(tài)觀察：稱(chēng)重后，腸管平鋪在紙板上，大頭針固定樣本四角，保持腸管平整，黏膜面朝向固定液，樣本固定48 h后送檢。常規(guī)蘇木精-伊紅染色，觀察肛腸組織的病理學(xué)改變。參照文獻(xiàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]并結(jié)合結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分（HS）標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定為輕微、輕度、中度、重度，分別記為1～4分，無(wú)病變標(biāo)記為0分，缺失記“無(wú)”，損傷性改變包括上皮壞死、脫落、缺失，充血，水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；分值越高，損傷越重。①上皮細(xì)胞：有杯狀細(xì)胞丟失記1分；杯狀細(xì)胞大面積丟失記2分；隱窩細(xì)胞丟失記3分；隱窩細(xì)胞大面積丟失記4分。②充血：未見(jiàn)明顯充血記1分；可見(jiàn)明顯充血記2分；嚴(yán)重充血記3分。③水腫：輕度水腫記1分；中度水腫記2分；重度水腫記3分。④炎性細(xì)胞浸潤(rùn)：浸潤(rùn)在隱窩基底層記1分；浸潤(rùn)達(dá)黏膜肌層記2分；浸潤(rùn)深達(dá)黏膜肌層，伴黏膜增厚、腺體破壞記3分；浸潤(rùn)深達(dá)黏膜下層，結(jié)構(gòu)明顯破壞記4分。個(gè)體評(píng)分用各評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記分總和表示，各組組織損傷程度用所有個(gè)體評(píng)分的均值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2013錄入數(shù)據(jù)，SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（QL，QU）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠肛腸黏膜大體觀

空白對(duì)照組大鼠直腸形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)黏膜出血、水腫和潰瘍；D3組大鼠直腸黏膜潰瘍、損傷明顯，可見(jiàn)出血水腫，輕微擠壓可見(jiàn)透明狀滲出物；D7組大鼠直腸黏膜損傷情況較D3組有所改善，局部充血、水腫減輕，潰瘍面積減小、顏色變淺。單次造模組大鼠可見(jiàn)部分直腸黏膜損傷，甚至充血，但損傷較淺且同一水平黏膜比較，損傷程度不一，提示造模效果未達(dá)到均勻。因此，從大體形態(tài)觀察角度，可以認(rèn)為D3、D7組造模效果優(yōu)于單次造模組，且D3組正處于損傷高峰期，與痔病急性期表現(xiàn)有高度相似性。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠直腸黏膜大體觀

2.2 大鼠肛腸系數(shù)比較

三組間肛腸系數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與D3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，而D7組與空白對(duì)照組、D3組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P?0.05），見(jiàn)表1。從肛腸系數(shù)角度分析，D3組造模效果優(yōu)于D7組。單次造模組肛腸系數(shù)為0.0760（0.0658，0.0799），呈偏態(tài)分布，且該組肛腸黏膜大體觀損傷面積、程度不均勻，結(jié)合以上兩點(diǎn)依據(jù)可認(rèn)為該組造模不成功，故未與其他各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

表1 大鼠肛腸系數(shù)比較

2.3 大鼠肛腸黏膜病理情況

空白對(duì)照組肛腸黏膜未見(jiàn)明顯異常，各觀察項(xiàng)目均記為0分。單次造模組大鼠由于造模不成功未做病理切片。D3、D7組大鼠肛腸黏膜組織病理學(xué)評(píng)分比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P?0.05）。與空白對(duì)照組比較，光鏡下可見(jiàn)D3組大鼠肛腸黏膜部分上皮細(xì)胞壞死脫落，間質(zhì)疏松水腫伴有大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層可見(jiàn)充血，血管擴(kuò)張多以小靜脈為主。D7組大鼠肛腸黏膜充血、水腫癥狀較前減輕，但仍存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)。3組大鼠肛腸黏膜病理結(jié)果見(jiàn)圖2。大鼠肛腸黏膜病理結(jié)果與大體觀、肛腸系數(shù)結(jié)果總體相符。D3、D7組大鼠肛腸組織病理學(xué)損傷評(píng)分見(jiàn)表2。

圖2 大鼠肛腸組織病理形態(tài)（蘇木精-伊紅染色，×10）

表2 D3、D7組大鼠肛腸組織病理學(xué)損傷評(píng)分比較 分，±s

表2 D3、D7組大鼠肛腸組織病理學(xué)損傷評(píng)分比較 分，±s

組別D3組（n=10）D7組（n=10）上皮脫落/壞死/缺失2.30±0.82 1.90±0.87充血/出血1.50±0.70 0.80±0.70水腫0.50±0.42 0.60±0.51炎性細(xì)胞浸潤(rùn)2.20±0.63 1.90±0.73總分6.50±2.37 5.20±2.34 tP 1.233 0.234

3 討論

痔病臨床癥狀多表現(xiàn)為墜脹、便血、疼痛等，這與病變黏膜炎性水腫、血管損傷密切相關(guān)[14]，肛腸系數(shù)可準(zhǔn)確反映病灶局部的變化，可作為痔病模型的定量評(píng)估參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中D3、D7組大鼠肛腸黏膜局部血管通透性改變、組織間質(zhì)水腫滲出明顯，導(dǎo)致組織體積密度變化，單位組織的重量不同程度增加。單次造模組大鼠肛腸系數(shù)雖有一定程度增加，其肛腸黏膜大體觀水腫程度不明顯，黏膜損傷較輕，不完全符合病灶表現(xiàn)。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，D3、D7組可見(jiàn)部分上皮組織缺損，黏膜層充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，與人類(lèi)痔病患者肛腸黏膜組織發(fā)生的病理改變相似。造模后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肛腸黏膜水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度輕微減輕，余病理變化仍然存在，但是兩組病理?yè)p傷積分相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為該模型穩(wěn)定性高。痔局部病理指標(biāo)可以準(zhǔn)確判定病變的輕重程度，是痔病模型效果評(píng)價(jià)的直接相關(guān)指標(biāo)[11]。因此，結(jié)合痔病模型制備規(guī)范及本次模型制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可認(rèn)為大鼠肛腸黏膜大體形態(tài)、肛腸系數(shù)和病理表現(xiàn)等是判斷痔病模型制備是否成功的重要指標(biāo)。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)在于規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，采用多次局部誘導(dǎo)方法，使模型達(dá)到均一、穩(wěn)定的效果。醋酸是一種化學(xué)試劑，在常溫下是一種具有強(qiáng)烈刺激性酸味的無(wú)色液體，可以使組織水腫、產(chǎn)生潰瘍[15-16]。黎小平等[17]曾以4%醋酸棉簽經(jīng)大鼠肛門(mén)置入直腸時(shí)間為1 min、深度為3 cm的方式造模使大鼠直腸黏膜損傷，形成類(lèi)似痔的病理變化；程雷等[18]采用1%的醋酸溶液3 mL經(jīng)肛門(mén)灌注大鼠結(jié)直腸腔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏膜和黏膜下層損傷最嚴(yán)重程度見(jiàn)于第1～3天。本研究利用醋酸這一特性，通過(guò)局部應(yīng)用誘導(dǎo)，使動(dòng)物肛腸黏膜發(fā)生水腫、潰瘍，從而模仿臨床痔病急性發(fā)作期的癥狀及病理改變。為了僅形成大鼠肛腸黏膜損傷，本實(shí)驗(yàn)采用棉簽蘸取10%醋酸局部造模。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，單次造模組多出現(xiàn)黏膜損傷較輕或者不均勻現(xiàn)象，而多次誘導(dǎo)的D3、D7組模型均一穩(wěn)定。醋酸屬水溶劑，采用棉簽造模時(shí)因?yàn)橹亓σ蛩兀つず蟊趽p傷大于兩側(cè)壁及前壁，易影響造模穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)表明采用3次造模方式及規(guī)范化操作可以更好地控制模型病灶，得到均一度、穩(wěn)定性、重復(fù)性更好的動(dòng)物模型，且模型病變范圍、病變程度更匹配人類(lèi)痔病患者的病理生理學(xué)特點(diǎn)，較好地模擬人類(lèi)痔病的病理過(guò)程，使動(dòng)物模型更貼近臨床。

綜上所述，本方法可以建立起接近人類(lèi)痔病病理?yè)p傷表現(xiàn)且穩(wěn)定可靠的大鼠肛腸黏膜損傷模型，且操作簡(jiǎn)單、成功率高、穩(wěn)定性好，可作為研究痔病各種治療方法的重要基礎(chǔ)。