李勇，萬(wàn)道印

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江 佳木斯 154000)

紅松球果即松科(Pinaceae)松屬(Pinus) 常綠喬木紅松(Pinuskoraiensis)的松塔[1]。球果富含揮發(fā)油，其有效成分具有抗病毒、消炎、抑菌等功效，是一種有較好應(yīng)用前景的天然藥用資源[2]。

當(dāng)前關(guān)于紅松球果資源利用的研究較少，球果揮發(fā)油的提取依然沿用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法。此方法操作簡(jiǎn)單、成本低，是植物有效成分提取領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的方法，但也存在著提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、效率低等弊端。酶法提取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的一種植物有效成分提取新方法，其原理是利用酶破壞植物細(xì)胞壁，加速有效成分的溶出。與傳統(tǒng)提取方法相比，此方法對(duì)設(shè)備要求不高，作用條件溫和，提取效率高[3-4]。

本試驗(yàn)以傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取法為基礎(chǔ)，先對(duì)脫種后的紅松球果進(jìn)行酶解處理，加速揮發(fā)油的溶出和擴(kuò)散，再進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取[5]。以期既保留傳統(tǒng)提取方法的優(yōu)點(diǎn)，又能顯著提高揮發(fā)油得率，為實(shí)際生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)材料、儀器與試劑

紅松球果脫種剩余物(采集自黑龍江省伊春市大箐山縣帶嶺鎮(zhèn))，數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠)，電子調(diào)溫電熱套(上海邦西儀器科技有限公司)，分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，電子天平(永康五鑫恒器有限公司)，固體樣品粉碎機(jī)(上海新諾儀器設(shè)備有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，臺(tái)式酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)，揮發(fā)油測(cè)定器(泰州東方科教儀器廠)，纖維素酶(濟(jì)寧和信生物技術(shù)有限公司)，果膠酶(Sigma公司)，檸檬酸(致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鈉(利揚(yáng)化工有限公司)，無(wú)水硫酸鈉(恒興化學(xué)試劑有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量經(jīng)粉碎后的紅松球果脫種剩余物，分別加入適量的纖維素酶、果膠酶或其混合酶，按相應(yīng)料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值,在一定溫度下酶解適當(dāng)時(shí)間后，蒸餾提取揮發(fā)油，計(jì)算揮發(fā)油得率[6]。

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶的選擇。稱(chēng)取40 g經(jīng)粉碎后的原料，調(diào)節(jié)料液比為1∶8(g/mL),pH值為4,酶解時(shí)間為2.5 h,酶解溫度為45 ℃，分別加入1.1%(酶量占混合液的質(zhì)量比值)的纖維素酶、果膠酶、纖維素酶和果膠酶的混合酶(質(zhì)量比1∶2，1∶1，2∶1)，蒸餾提取揮發(fā)油，比較揮發(fā)油得率，確定最佳提取酶/最佳混合比例。

2.1.2 料液比的選擇。稱(chēng)取40 g經(jīng)粉碎后的原料，加入1.1%纖維素酶和果膠酶的混合酶，調(diào)節(jié)pH值為4,酶解時(shí)間為2.5 h,酶解溫度為45 ℃，比較料液比為1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10(g/mL)時(shí)的揮發(fā)油得率，確定最佳料液比。

2.1.3 酶添加量的選擇

稱(chēng)取40 g經(jīng)粉碎后的原料，調(diào)節(jié)料液比為1∶8(g/mL),pH值為4,酶解時(shí)間為2.5 h,酶解溫度為45℃，比較酶的添加量分別為0.5%、0.8%、1.1%、1.4%、1.7%、2%時(shí)的揮發(fā)油得率，確定最佳酶添加量。

2.1.4 酶解pH值的選擇。稱(chēng)取40 g經(jīng)粉碎后的原料，加入1.1%纖維素酶和果膠酶的混合酶，調(diào)節(jié)料液比為1∶8(g/mL),酶解時(shí)間為2.5 h,酶解溫度為45 ℃，比較pH值分別為2.5,3,3.5,4,4.5,5,5.5時(shí)的揮發(fā)油得率，確定最佳酶解pH值。

2.1.5 酶解溫度的選擇。稱(chēng)取40 g經(jīng)粉碎后的原料，加入1.1%纖維素酶和果膠酶的混合酶，調(diào)節(jié)料液比為1∶8(g/mL),pH值為4，酶解時(shí)間為2.5 h,比較酶解溫度分別為30,35,40,45,50,55 ℃時(shí)的揮發(fā)油得率，確定最佳酶解溫度。

2.1.6 酶解時(shí)間的選擇。稱(chēng)取40 g經(jīng)粉碎后的原料，加入1.1%纖維素酶和果膠酶的混合酶，調(diào)節(jié)料液比為1∶8(g/mL),pH值為4，酶解溫度為45 ℃，比較酶解時(shí)間分別為1,1.5,2,2.5,3,3.5,4 h時(shí)的揮發(fā)油得率，確定最佳酶解時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，稱(chēng)取40 g經(jīng)粉碎后的原料，調(diào)節(jié)料液比為1∶8(g/mL),以酶添加量，pH值，酶解溫度，酶解時(shí)間為影響因素，以揮發(fā)油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)的正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化工藝。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

3 結(jié)果與分析

3.1 酶的種類(lèi)/混合比例對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由試驗(yàn)結(jié)果(圖1)可知，酶的加入可以提高原料的揮發(fā)油得率，加入纖維素酶和果膠酶的混合酶(質(zhì)量比1∶1)得油率最高，選擇纖維素酶和果膠酶的混合酶作為球果揮發(fā)油的提取酶。

圖1 酶的種類(lèi)/混合比例對(duì)揮發(fā)油得率的影響

植物細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠組成。加入足量的纖維素酶和果膠酶，可以通過(guò)酶解破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有助于加速油脂分子的釋放溶出。纖維素酶與果膠酶之間存在著協(xié)同作用，兩種酶混合使用酶解效果最佳。

3.2 料液比對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由試驗(yàn)結(jié)果(圖2)可知，料液比對(duì)原料的揮發(fā)油得率存在影響，當(dāng)料液比為1∶8時(shí)，揮發(fā)油得率最高，確定為本試驗(yàn)的最佳料液比。

圖2 料液比對(duì)揮發(fā)油得率的影響

料液比較低時(shí)，溶液不能充分滲入到原料中，酶和底物難以充分接觸，不利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和油脂分子的溶出；料液比較高時(shí)，酶和底物的濃度較低，酶分子與底物分子的碰撞幾率降低，酶的作用效果下降。

3.3 酶添加量對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由試驗(yàn)結(jié)果(圖3)可知，隨著酶量的增加，揮發(fā)油得率不斷升高；當(dāng)酶的添加量為1.4%時(shí)，原料的揮發(fā)油得率最高，確定為本試驗(yàn)的最佳酶添加量；當(dāng)加酶量超過(guò)1.4%時(shí)，揮發(fā)油得率增長(zhǎng)有限，趨于平穩(wěn)。

圖3 酶添加量對(duì)揮發(fā)油得率的影響

酶添加量是影響揮發(fā)油提取的重要因素之一。酶添加量不足，酶解反應(yīng)不完全；隨著酶濃度的增加，酶解反應(yīng)越發(fā)充分；酶添加量過(guò)多，造成浪費(fèi)的同時(shí)甚至可能影響揮發(fā)油品質(zhì)。

3.4 酶解pH值對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由試驗(yàn)結(jié)果(圖4)可知，隨著pH值的增加，原料的揮發(fā)油得率逐漸增加；當(dāng)pH值為4.5時(shí)，揮發(fā)油得率最高，確定為本試驗(yàn)的最佳pH值；pH值繼續(xù)增大，揮發(fā)油得率下降。

圖4 酶解pH值對(duì)揮發(fā)油得率的影響

酶的活性受pH值的影響，酶在最適pH值時(shí)擁有最高的酶活，偏離其最適pH值，酶活下降，酶解效果不佳。

3.5 酶解溫度對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由試驗(yàn)結(jié)果(圖5)可知，隨著酶解溫度的升高，原料的揮發(fā)油得率逐漸增加；當(dāng)酶解溫度為45 ℃時(shí)，揮發(fā)油得率最高，確定為本實(shí)驗(yàn)的最佳酶解溫度；繼續(xù)升高溫度，揮發(fā)油得率呈下降趨勢(shì)。

圖5 酶解溫度對(duì)揮發(fā)油得率的影響

溫度是影響酶活性的重要因素之一。酶在最適溫度環(huán)境中活性最高，酶解反應(yīng)速率最快。低溫會(huì)抑制酶的活性，過(guò)高的溫度會(huì)使酶失活。

3.6 酶解時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由試驗(yàn)結(jié)果(圖6)可知，隨著酶解時(shí)間的增加，揮發(fā)油得率逐漸增加；當(dāng)酶解時(shí)間為3h時(shí)，揮發(fā)油得率最高，確定為本實(shí)驗(yàn)的最佳酶解時(shí)間；繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，揮發(fā)油得率增長(zhǎng)有限，趨于平穩(wěn)。

酶解反應(yīng)需要一定的時(shí)間，酶與底物充分接觸，有利于植物細(xì)胞壁的破壞，加速油脂的釋放溶出。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響

3.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果(表2)可知，4個(gè)因素對(duì)揮發(fā)油得率影響的主次順序?yàn)锳>B>D>C，即酶添加量>pH值>酶解時(shí)間>酶解溫度；優(yōu)化的最佳組合為A3B2C2D3，即酶添加量1.7%、酶解pH值為4.5、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間3.5 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

將優(yōu)化的最佳組合A3B2C2D3與(表2)中的最優(yōu)組合A3B2C1D3進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)(見(jiàn)表3)。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由試驗(yàn)結(jié)果(表3)可知，最佳提取工藝條件為A3B2C2D3：酶添加量1.7%，酶解pH為4.5，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間3.5 h。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以紅松球果脫種剩余物為原料，經(jīng)粉碎、酶解、水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝條件為：選用纖維素酶和果膠酶的混合酶(質(zhì)量比1∶1)，料液比1∶8，酶添加量1.7%，酶解pH為4.5，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間3.5 h，在此工藝條件下，揮發(fā)油得率為1.775%。此提取方法操作簡(jiǎn)單易行，對(duì)設(shè)備要求不高，工藝運(yùn)行成本低，綜合效益顯著。