張運(yùn)尚，杜加茹，王偉東，樊劍鳴

（鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南鄭州 450001）

氟喹諾酮類(lèi)藥物（Fluoroquinolones，F(xiàn)QS）是第3 代喹諾酮藥物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是在喹啉環(huán)的6 位上加入了氟原子，7 位上連有哌嗪基的一類(lèi)衍生物，此特點(diǎn)使得原本親脂性的吡酮類(lèi)藥物增加了適度的親水性，同時(shí)降低了蛋白結(jié)合率，提高生物利用度[1-2]。該類(lèi)藥物通過(guò)抑制細(xì)菌的DNA 和RNA 合成從而達(dá)到抑菌作用[3]。相比第1 代及第2 代喹諾酮藥物，F(xiàn)QS 的抗菌活性明顯增加，抗菌譜顯著擴(kuò)大，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（金葡球菌、鏈球菌、肺炎球菌）和革蘭氏陰性菌（腸桿菌科、流感桿菌和奈瑟菌屬）[4]以及一些衣原體、支原體和螺旋體均有抗菌作用[5]，因此被廣泛應(yīng)用在臨床上治療細(xì)菌感染性疾病。FQS 代表藥物主要包括恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、達(dá)氟沙星（Danofloxacin，DAN）、氟羅沙星（Flero xacin，F(xiàn)LE）、沙拉沙星（Saraflaxacin，SFX）、依諾沙星（Enoxacin，EX）等。由于養(yǎng)殖業(yè)對(duì)食品中獸藥殘留的意識(shí)不足，存在大量不規(guī)范使用獸藥、抗生素及違禁藥品和不嚴(yán)格執(zhí)行休藥期規(guī)定等諸多問(wèn)題，使得動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留超標(biāo)[6]。隨著我國(guó)居民生活水平提高，對(duì)動(dòng)物性食品的需求也不斷增加。當(dāng)人們過(guò)多食用了含有藥物殘留的動(dòng)物性食品后，通常不表現(xiàn)為急性毒性，而是藥物在人體蓄積[7-8]，對(duì)人體多個(gè)系統(tǒng)（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等）造成損害[9-13]。更為嚴(yán)重的是，F(xiàn)QS 的不合理使用容易誘導(dǎo)人類(lèi)致病菌對(duì)其耐藥性的增強(qiáng)，不利于該類(lèi)藥物對(duì)人類(lèi)疾病的治療[14-17]。本文綜述了FQS 在動(dòng)物源性食品中殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和3 種檢測(cè)FQS 的常用方法，以期為在不同檢測(cè)條件下選擇最適的檢測(cè)方法提供理論依據(jù)。

1 FQS 殘留限量

FQS 殘留存在諸多不良反應(yīng)，逐漸引起世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。為了監(jiān)控獸藥在動(dòng)物性食品中的殘留，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)席專家委員會(huì)（JECFA）早在1987 年第32 次會(huì)議中報(bào)告了相關(guān)獸藥的殘留毒性；從1997 年8 月20 日起，美國(guó)禁止將FQS 作為非限制性藥物使用；美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)（21CFRS530，41）規(guī)定的禁用獸藥品種（不能使用于供食用的動(dòng)物）也包括FQS 類(lèi)藥物[18]；歐盟（EC）于2009 年12 月22 日發(fā)布了37/20210 號(hào)法，其中關(guān)于動(dòng)物性食品及其產(chǎn)品中獸藥殘留（B 類(lèi)）制定最高殘留限量（MRLs）包括喹諾酮類(lèi)藥物[19]。日本于2003 年7 月1 日起對(duì)進(jìn)口生鰻魚(yú)及其制品進(jìn)行氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留檢測(cè)，并規(guī)定最大殘留限量為50 μg/kg[20]；我國(guó)頒布的首批綠色畜產(chǎn)品論證準(zhǔn)則《綠色食品—獸藥使用準(zhǔn)則》也取消了FQS 在肉用動(dòng)物上的使用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部獸藥殘留專家委員會(huì)在參考JECFA 及美國(guó)（CFR）和EC 有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，制定了恩諾沙星（Enrofloxacin）、二氟沙星（Difloxacin）、達(dá)氟沙星（Danofloxacin）在動(dòng)物性食品中最大殘留限量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[21]，具體見(jiàn)表1。

2 FQS 殘留檢測(cè)方法

目前，針對(duì)FQS 的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）等。不同分析方法對(duì)FQS 的檢測(cè)結(jié)果優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表2。

2.1 HPLC 色譜法原理是利用樣品中各個(gè)組分的物理化學(xué)性質(zhì)差異（如分子大小及形狀、親和力、分配系數(shù)和吸附力等），使各組分在固定相和流動(dòng)相中的分布程度不同，從而以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離樣品的目的。高效液相色譜法又稱“高分離度液相色譜”，是色譜法的一個(gè)重要分支。HPLC 利用高壓輸液系統(tǒng)將不同極性的液體流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，流動(dòng)相的各個(gè)組成成分在色譜柱內(nèi)被分離開(kāi)后，進(jìn)入檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，最后通過(guò)分析對(duì)比這些信號(hào)判斷待測(cè)樣品所含物質(zhì)。根據(jù)檢測(cè)器的種類(lèi)可以將HPLC 分為不同的方法，如高效液相色譜-紫外吸收檢測(cè)法（HPLC-UV/DAD）、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（HPLC-FLD）、高效液相色譜-固相萃?。℉PLC-SPE）。HPLC 法具有應(yīng)用范圍廣、分離能力強(qiáng)、測(cè)定靈敏度高、樣品易回收等特點(diǎn)。

方永衛(wèi)等[22]利用HPLC 法建立動(dòng)物性產(chǎn)品中3 種FQS（麻保沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星）含量的方法，設(shè)置波長(zhǎng)為278～299 nm，采用流動(dòng)相為A 液為0.05 mol/L磷酸0.5%三乙胺溶液，B 液為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫，得到最佳色譜分離圖，表明3 種目標(biāo)藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，3 種藥物的檢測(cè)限為0.5 μg/mL。樣品的添加回收率均在82.0%～105.6%，證明該方法用于動(dòng)物性食品提取方法的可靠性較好，可以用于檢測(cè)動(dòng)物性食品中的FQS 殘留。

表1 獸用氟喹諾酮藥物在動(dòng)物源性食品中最大殘留限量 μg/kg

表2 幾種分析方法對(duì)不同F(xiàn)QS 藥物的檢測(cè)結(jié)果優(yōu)缺點(diǎn)比較

Vakh 等[23]使用Zr-Fe-C 磁性納米粒子作為吸附劑進(jìn)行自動(dòng)磁分散微固相萃取，測(cè)定肉類(lèi)嬰兒食品中的氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物（氟羅沙星、諾氟沙星和氧氟沙星）含量。該方法將樣品溶液注入流化反應(yīng)器中，然后基于流化床策略使用磁性納米顆粒從樣品基質(zhì)中在線分離分析物，并使用高效液相色譜系統(tǒng)洗脫和測(cè)定分析物。在實(shí)驗(yàn)最佳條件下，3 種藥物的濃度為5～1 000 μg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。計(jì)算得出的檢出限為氟羅沙星3.0 μg/L，諾氟沙星和氧氟沙星1.5 μg/L。所有分析物的回收率均在86%～122%。該方法檢出限低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可以用于測(cè)定肉類(lèi)嬰兒食品中的FQS 含量。

2.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）質(zhì)譜法原理是將樣品的分子進(jìn)行電離，不同質(zhì)量的電子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)中，按照質(zhì)荷比的大小和相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行分離和排序，形成有規(guī)則的質(zhì)譜，從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。HPLC-MS/MS 法是常見(jiàn)的一種色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)，首先將樣品中的分析物經(jīng)過(guò)液相色譜柱分離后輸送至質(zhì)譜，根據(jù)特定的質(zhì)荷比（m/z）離子進(jìn)行選擇，所選擇的母離子可以產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)信息的離子產(chǎn)物，進(jìn)而可以對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性的定量分析。相比于HPLC，HPLC-MS 分離能力更強(qiáng)，分析結(jié)果具有更高的可靠性。

曹騫等[24]利用HPLC-MS/MS 建立了雞蛋中8 種喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方法，該方法對(duì)雞蛋中各類(lèi)化合物的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，線性范圍為1～100 μg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.996 7。在空白雞蛋樣品中添加20 ng/mL 的8 種喹諾酮類(lèi)藥物進(jìn)行回收試驗(yàn)，平均回收率范圍為83.0%～108.5%。該方法靈敏度較高，可以用于檢測(cè)雞蛋中FQS 殘留。

不同樣品基質(zhì)中FQS 液相檢測(cè)方法見(jiàn)表3?？梢钥闯鯤PLC 具有分離度高、靈敏度好及準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，是目前檢測(cè)FQS 殘留使用較多的方法，但其對(duì)樣品的前處理時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)過(guò)程較為復(fù)雜，不能滿足大批量檢測(cè)的需求，同時(shí)還存在溶劑消耗較大、對(duì)環(huán)境有較大污染等弊端。而相比于HPLC，HPLC-MS/MS 不僅具有色譜法的分離能力，還具有質(zhì)譜法的靈敏度、選擇性和識(shí)別能力，對(duì)于某些分子量大、極性強(qiáng)、穩(wěn)定性差的樣品有較好的分離檢測(cè)和定性分析能力。利用HPLC-MS/MS 針對(duì)FQS 殘留的檢出限和定量限均高于HPLC，MS 提供了檢測(cè)組織提取物中FQS 所需的特異性，該方法適合用于FQS 殘留的確證。但是，該方法需要的儀器設(shè)備昂貴，對(duì)樣品的前處理較復(fù)雜，對(duì)操作人員的要求也較高，導(dǎo)致該方法難以在基層工作中普及。

2.3 ELISA 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的基本原理是將抗原或抗體固定在特殊材料上，與其酶標(biāo)的抗體或抗原發(fā)生特異性的反應(yīng)，在高效的酶促反應(yīng)下，達(dá)到擴(kuò)大免疫反應(yīng)的作用。利用FQS 中的羧基與載體蛋白質(zhì)游離氨基的縮合反應(yīng)，將FQS 與載體連接合成人工抗原，該方法簡(jiǎn)單，快速，且不需要昂貴的儀器設(shè)備，適用于大量樣品的快速檢測(cè)[32]。同時(shí)該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于現(xiàn)場(chǎng)樣品的檢測(cè)，因此近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用ELISA 法測(cè)定抗生素殘留的研究越來(lái)越多。我國(guó)也在2008 年發(fā)布了《動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)-酶聯(lián)免疫吸附法》（農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-8-2008）標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了在動(dòng)物性食品中FQS 殘留量檢測(cè)的制樣和酶聯(lián)免疫吸附法，適用于動(dòng)物源性食品中豬和雞的肌肉、蜂蜜、雞蛋和蝦中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等FQS 殘留量的檢測(cè)。

表3 不同樣品基質(zhì)中FQS 類(lèi)藥物液相檢測(cè)方法的比較

李建鯤等[33]利用酶聯(lián)免疫吸附法快速測(cè)定肉制品中FQS 殘留，計(jì)算50%抑制濃度（IC50 值）可知FQS酶聯(lián)免疫試劑盒的相關(guān)系數(shù)R 為0.997 6，百分吸光率標(biāo)準(zhǔn)曲線中4 次零濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的IC50 介于0.306～0.351 ng/g，表明FQS 的濃度與百分吸光率呈負(fù)相關(guān)。在0～ 400 ng/g 時(shí)，添加回收率在81.8%～100.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD） 在0.4%～12%，說(shuō)明ELISA 法檢測(cè)牛肉、羊肉、豬肉和雞肉中FQS 準(zhǔn)確、可靠，且重復(fù)性好、精密度高。

李燕君等[34]利用ELISA 法同時(shí)檢測(cè)牛奶中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星等6 種FQS 殘留，該方法的IC50 范圍在0.254～0.361 μg/L，最低檢測(cè)限為1.48 μg/L，在牛奶中添加5 μg/L 環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星等6 種FQS 類(lèi)藥物時(shí)，回收率為87.20%～115.92%；同一批內(nèi)的變異系數(shù)均小于15.0%，不同批間的變異系數(shù)均小于16.0%。該方法的精密度（變異系數(shù)）、回收率和最低檢測(cè)限等均符合獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范的要求，且回收率和最低檢測(cè)限與高效液相色譜法相接近，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，并且操作相對(duì)簡(jiǎn)單，容易在基層工作中推廣普及，適合進(jìn)行大批量樣本的快速檢測(cè)。

孫曉崢等[35]用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（ci-ELISA）試驗(yàn)成功地檢測(cè)了肉雞組織中環(huán)丙沙星（CIP）的殘留，將敏感性強(qiáng)的單抗與膠體金顆粒標(biāo)記作為金標(biāo)墊，以CIP-BSA 偶聯(lián)蛋白為檢測(cè)線，以兔抗鼠IgG 作為質(zhì)控線，組裝了檢測(cè)FQS 藥物的膠體金免疫層析試紙條，檢測(cè)肉雞中CIP 的殘留，結(jié)果表明該方法對(duì)10 種FQS 檢測(cè)均為陽(yáng)性，而檢測(cè)的4 種常見(jiàn)藥物均為陰性。對(duì)環(huán)丙沙星、培氟沙星、達(dá)氟沙星的檢測(cè)限為3.2 ng/mL，對(duì)沙拉沙星、二氟沙星、麻保沙星的檢測(cè)限為6.4 ng/mL。該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)所需時(shí)間短、靈敏度較高、特異性較強(qiáng)，為大量樣品的篩選和快速檢測(cè)提供了一種可靠的方法。

Yuan等[36]利用一種基于等離子體銀納米棱鏡（AgNPR）氧化蝕刻的酶聯(lián)免疫吸附法（pELISA），用于達(dá)氟沙星的定性和定量檢測(cè)。該方法以AgNPR 作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器，通過(guò)引入生物素標(biāo)記的單克隆抗體、鏈霉親和素和生物素化葡萄糖氧化酶構(gòu)建間接競(jìng)爭(zhēng)的pELISA，催化H2O2的生成來(lái)刻蝕AgNPR。該方法對(duì)牛奶中達(dá)氟沙星的定量檢出限為0.24 ng/mL，定性檢測(cè)限為0.32 ng/mL，平均回收率為103%～121%，變異系數(shù)為0.6%～3.41%。用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)一步證實(shí)了上述回收結(jié)果。根據(jù)結(jié)果可知，AgNPR 蝕刻pELISA法對(duì)牛奶中達(dá)氟沙星的定量和定性檢測(cè)具有較高靈敏度、準(zhǔn)確性和可靠性，可以用作牛奶中氟喹諾酮類(lèi)藥物的殘留檢測(cè)。

不同分析方法對(duì)FQS 的檢測(cè)結(jié)果優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表3。盡管相比于HPLC 和HPLC-MS，ELISA 的檢出限和定量限較高，但仍遠(yuǎn)低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。該方法具有操作簡(jiǎn)單，所需時(shí)間短、成本低等諸多優(yōu)勢(shì)，適用于作為食品中FQS 類(lèi)藥物殘留的初步檢測(cè)。近年來(lái)，ELISA 為FQS 殘留檢測(cè)提供了諸多便利。隨著科學(xué)發(fā)展，基于免疫法的檢測(cè)方法不斷創(chuàng)新，靈敏度不斷提高，今后的研究重點(diǎn)可側(cè)重于提高該方法的穩(wěn)定性和特異性。

3 展 望

隨著分析技術(shù)和新型材料的快速發(fā)展，HPLC、HPLC-MS/MS、ELISA 等方法被廣泛應(yīng)用于FQS 殘留的檢測(cè)。目前常用的HPLC 法雖然準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，但所需儀器昂貴、操作復(fù)雜、對(duì)樣品的前處理繁瑣等。隨著免疫技術(shù)的不斷發(fā)展，使用ELISA 法檢測(cè)FQS 殘留的研究越來(lái)越多，該方法靈敏度較高、特異性強(qiáng)，相比于HPLC 法具有簡(jiǎn)便、快捷等優(yōu)勢(shì)，適用于對(duì)樣品的初步殘留檢測(cè)。因此，可以預(yù)測(cè)ELISA 法將會(huì)在快速篩選大批量樣品的FQS 殘留中發(fā)揮重要作用。