鄭丹丹，李 靖，王永林，李勇軍，劉 亭

1)貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 貴陽(yáng) 550025 2)貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴陽(yáng) 550004 3)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 貴陽(yáng) 550025 4)貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心 貴陽(yáng) 550004

細(xì)胞色素P450家族2亞家族A成員13(CYP2A13)是最近研究發(fā)現(xiàn)的比較重要的一類CYP450，其表達(dá)有組織特異性，主要在人肺部、支氣管以及鼻咽喉等呼吸道組織中表達(dá)[1-2]。研究[1-2]表明，煙草特異性致癌物4-甲基亞硝胺-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)以及黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)等環(huán)境致癌物可被CYP2A13高效代謝活化，并且CYP2A13遺傳多態(tài)性可影響人體環(huán)境毒物敏感性。

在CYP2A13已報(bào)道的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)中，有9個(gè)位于外顯子區(qū)域，共產(chǎn)生8種突變體，分別是CYP2A13*2、*3、*4、*5、*6、*7、*8和*9，其中*3、*4和*7突變體均無(wú)活性，而*2、*5、*6、*8和*9突變體具有代謝活性，并能引起NNK相關(guān)肺癌易感性的個(gè)體差異[3-4]。本文擬構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13*1(野生型)、*2、*5、*6、*8和*9的Flp-InTMCHO細(xì)胞系，為體外研究CYP2A13多態(tài)性對(duì)人體環(huán)境毒物敏感性的影響提供工具。

1 材料與方法

1.1主要材料pcDNA5/FRT載體、Flp-InTMCHO細(xì)胞系由浙江大學(xué)陳樞青教授免費(fèi)贈(zèng)送。pOG44質(zhì)粒，含CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8和*9基因片段的pGEM-T重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。HindⅢ、NotⅠ、T4等工具酶均購(gòu)自Invitrogen公司；Ham′s F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Trizol試劑購(gòu)自Gibco公司；TOP10感受態(tài)細(xì)菌、氨芐青霉素、潮霉素B、質(zhì)粒提取試劑盒、ECL Plus超敏發(fā)光液、RIPA裂解液均購(gòu)自索萊寶公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗CYP2A13抗體均購(gòu)自Abcam公司；AFB1購(gòu)自Sigma公司；MTS、FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Promega公司；熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。PCR引物由上海恒英公司合成，引物如下：GAPDH上游引物為5’-GAGTCAACG GATTTGGTCGT-3’，下游引物為5’-GACAAGCTTC CCGTTCTCAG-3’；CYP2A13上游引物為5’-CCTG GTGATGACCACCC-3’，下游引物為5’-CGTGGAT CACTGCCTCTG-3’。多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Scientific公司；凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2pcDNA5-CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8和*9重組質(zhì)粒的構(gòu)建分別將pGEM-CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8和*9等質(zhì)粒用HindⅢ和NotⅠ雙酶切，切膠回收CYP2A13片段，并用T4連接酶連接CYP2A13片段和pcDNA5/FRT的HindⅢ和NotⅠ酶切產(chǎn)物。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌，挑取克隆培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，通過(guò)HindⅢ和NotⅠ雙酶切驗(yàn)證，挑選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆于-80 ℃保存。

1.3pcDNA5-CYP2A13轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系用含500 mg/L博來(lái)霉素的Ham′s F12完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Flp-InTMCHO細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)至6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合，用0.3 μg pcDNA5-CYP2A13質(zhì)粒及5 μg pOG44質(zhì)粒與10 μL FuGENE6混合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后用含600 mg/L潮霉素B的Ham′s F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4周，篩選候選陽(yáng)性克隆，并用含500 mg/L博來(lái)霉素的Ham′s F12完全培養(yǎng)基來(lái)驗(yàn)證候選陽(yáng)性克隆的博來(lái)霉素敏感性，得到陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆繼續(xù)以含600 mg/L潮霉素B的Ham′s F12完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。用pcDNA5/FTR空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.4CYP2A13mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)取以上方法構(gòu)建的陰性對(duì)照細(xì)胞(vehicle-CHO)和各CYP2A13-CHO細(xì)胞系進(jìn)行CYP2A13 mRNA測(cè)定。利用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系：1.0 μL cDNA，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，10 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5CYP2A13蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)利用RIPA裂解液提取vehicle-CHO和各CYP2A13-CHO細(xì)胞系總蛋白，并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將20 μg等量蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，胎牛血清封閉2 h。一抗(兔抗CYP2A13多克隆抗體，稀釋度1∶100；小鼠抗β-actin單克隆抗體，稀釋度1∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜后，二抗(稀釋度1∶2 000)室溫孵育2 h。用ECL Plus超敏發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像儀系統(tǒng)成像，使用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6AFB1對(duì)CYP2A13-CHO的細(xì)胞毒性用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1.5×105個(gè)/mL，然后轉(zhuǎn)至96孔板中，每孔加入100 μL，培養(yǎng)24 h?？瞻捉M用含體積分?jǐn)?shù)0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞給予AFB1(200 mg/L)處理24 h后，加入MTS溶液(100 μL Ham′s F12加入5 μL MTS)孵育2 h。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度(A)值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A培養(yǎng)基/A空白組-A培養(yǎng)基)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同組間CYP2A13 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量、細(xì)胞存活率的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1pcDNA5-CYP2A13質(zhì)粒的鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)HindⅢ和NotⅠ酶切后，出現(xiàn)了一條1 500 bp左右的條帶(圖1)。將陽(yáng)性克隆測(cè)序，結(jié)果與GenBank報(bào)道的CYP2A13基因(NG_007928)序列一致，說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2CYP2A13-CHO細(xì)胞模型的鑒定相比vehicle-CHO組細(xì)胞，各CYP2A13-CHO組中CYP2A13 mRNA和蛋白表達(dá)水平上升，細(xì)胞存活率降低(圖2，表1)。

M：DL15000 DNA Marker；1、2：pcDNA5-CYP2A13*1及其酶切；3、4：pcDNA5-CYP2A13*2及其酶切；5、6：pcDNA5-CYP2A13*5及其酶切；7、8：pcDNA5-CYP2A13*6及其酶切；9、10：pcDNA5-CYP2A13*8及其酶切；11、12：pcDNA5-CYP2A13*9及其酶切

1～6：CYP2A13*1、*2、*5、*6、*8、*9-CHO組；7：vehicle-CHO組

表1 各組細(xì)胞CYP2A13 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量、細(xì)胞存活率的比較(n=3)

3 討論

Flp-InTMCHO細(xì)胞基因組引進(jìn)了一個(gè)Flp重組酶的作用靶點(diǎn)(FLP recombination target，F(xiàn)RT)，表達(dá)載體中的目的基因通過(guò)Flp重組酶介導(dǎo)后，定點(diǎn)整合至FRT位點(diǎn)[5-6]。使用該細(xì)胞構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)插入、蛋白表達(dá)量一致，可以保證不同突變體蛋白表達(dá)量一致，便于進(jìn)行活性比較；將帶有目的基因的pcDNA5/FRT載體與pOG44載體共轉(zhuǎn)染Flp-InTMCHO宿主細(xì)胞，通過(guò)潮霉素B篩選28 d左右便可得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系且不需單克隆篩選，耗時(shí)短，工作量少[5-6]。故本文采用Flp-InTMCHO細(xì)胞進(jìn)行CYP2A13野生型和突變體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建。

SNP主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP是CYP450遺傳多態(tài)性的主要存在形式，其可產(chǎn)生多種突變體，且某些SNP可以改變基因表達(dá)或酶蛋白中氨基酸的組成，從而影響CYP450的合成和活力。CYP2A13可代謝激活A(yù)FB1等環(huán)境毒物，導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞癌變，對(duì)CYP2A13各SNP突變體進(jìn)行功能性研究，將為篩選環(huán)境致癌物易感人群提供重要的理論指導(dǎo)[7-8]。

在已報(bào)道[3-4]的CYP2A13的SNP中，CYP2A13*3、*4和*7均不表現(xiàn)出酶活性。故本實(shí)驗(yàn)只建立了表達(dá)CYP2A13野生型(CYP2A13*1)/突變體(CYP2A13*2、*5、*6、*8和*9)Flp-InTMCHO細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)表明，和轉(zhuǎn)染空載體的CHO細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染各個(gè)CYP2A13野生型和突變體的細(xì)胞中CYP2A13 mRNA和蛋白表達(dá)水平均增加，并且體現(xiàn)出較強(qiáng)的AFB1敏感性，說(shuō)明成功構(gòu)建了CYP2A13穩(wěn)定表達(dá)的Flp-InTMCHO細(xì)胞系。但是CYP2A13野生型和突變體表達(dá)細(xì)胞對(duì)AFB1敏感性差異不大。AFB1可被人體吸入，在體內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝活化，產(chǎn)生AFB1-8,9-環(huán)氧化物，表現(xiàn)出強(qiáng)毒性和致癌性[9]。以上結(jié)果表明，作為主要表達(dá)在人呼吸道中的AFB1優(yōu)勢(shì)代謝酶，CYP2A13的SNP多態(tài)性可能不會(huì)導(dǎo)致人體對(duì)AFB1敏感性的變化[10]。

綜上所述，本研究建立了穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13野生型和各突變體的Flp-InTMCHO細(xì)胞系，目的蛋白均能均一表達(dá)并發(fā)揮活性。以上工作為研究CYP2A13介導(dǎo)的環(huán)境毒物敏感性差異機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)工具。