劉錦妮，郝素旗，陳嘯欽，葉兆偉，吳海港*

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南信陽 464000；2.信陽市獸藥新制劑研發(fā)與創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，河南信陽 464000)

穿心蓮內(nèi)酯是來源于天然植物穿心蓮的二萜類內(nèi)酯化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、解熱及保護(hù)心腦血管等多種藥理活性[1-3]。然而由于穿心蓮內(nèi)酯在水中溶解度低、溶出速率慢，口服時體內(nèi)生物利用度差、在體內(nèi)不穩(wěn)定等問題，成為限制其應(yīng)用的主要瓶頸[4-6]。因此，解決穿心蓮內(nèi)酯在水中難溶和難溶出的問題，增加藥物吸收，改善其口服生物利用度成為眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)[7-9]。納米混懸劑是一種以表面活性劑作為助懸劑，將藥物顆粒分散在水中，通過粉碎或控制析晶技術(shù)形成的穩(wěn)定的納米膠態(tài)分散體系[10]。納米混懸劑作為一種新劑型，具有高載藥量、制備工藝簡單、可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于難溶性藥物制劑的制備，改善藥物溶出度和生物利用度。本試驗(yàn)采用反溶劑法為制備技術(shù)，以藥物穩(wěn)定性為指標(biāo)，通過對處方及制備工藝參數(shù)的篩選和優(yōu)化，探究穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的最優(yōu)制備工藝，為穿心蓮內(nèi)酯新型制劑研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 泊洛沙姆188(F68)、吐溫-80、十二烷基硫酸鈉、二甲基亞砜均購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；穿心蓮內(nèi)酯原料藥(含量≥93%，批號：170421)購于河南自然康生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 SCILOGEX磁力攪拌器，上海珂淮儀器有限公司；BT-9300ST激光粒度分布儀，廈門利特晶檢測科技有限公司；JEM2100透射電鏡，合肥吉納新材科技有限公司。

1.3 穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑制備工藝的單因素試驗(yàn)

1.3.1 穩(wěn)定劑濃度 穿心蓮內(nèi)酯濃度為40 mg/mL、攪拌時間為1 h、攪拌速率為1000 r/min、反溶劑和溶劑的體積比為10，F(xiàn)68的濃度為0.05%，考察吐溫-80濃度為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%對ANDRO-NS穩(wěn)定性的影響。

1.3.2 穿心蓮內(nèi)酯原料藥的濃度 F68濃度為0.05%、吐溫-80濃度為1%，攪拌時間為1 h、攪拌速率為1000 r/min、反溶劑和溶劑體積比為10，考察藥物濃度分別為20、30、40、50 mg/mL對ANDRO-NS穩(wěn)定性的影響。

1.3.3 反溶劑和溶劑體積比 F68濃度為0.05%、吐溫-80濃度為1%，攪拌時間為1 h、攪拌速率為1000 r/min、穿心蓮內(nèi)酯濃度為40 mg/mL，考察反溶劑和溶劑體積比分別為10、15、18、20時對ANDRO-NS穩(wěn)定性的影響。

1.3.4 攪拌時間 F68濃度為0.05%、吐溫-80濃度為1%，攪拌速率為1000 r/min、反溶劑和溶劑體積比為10、穿心蓮內(nèi)酯濃度為40 mg/mL，考察攪拌時間分別為60、80、100、120 min對ANDRO-NS穩(wěn)定性的影響。

1.3.5 攪拌速率的篩選 F68濃度為0.05%、吐溫-80濃度為1%，攪拌時間為1 h、反溶劑和溶劑體積比為10、穿心蓮內(nèi)酯濃度為40 mg/mL，考察攪拌速率分別為900、1100、1200、1400 r/min對ANDRO-NS穩(wěn)定性的影響。

1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)的考察，以ANDRO-NS得率為評價指標(biāo)，選取藥物濃度濃度(A)、攪拌速率(B)、攪拌時間(C)、反溶劑和溶劑體積比(D)為考察指標(biāo)，采用四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。

表1 ANDRO-NS正交試驗(yàn)因素水平

1.5 穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑制備驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取F68 0.0125 g、吐溫-80 0.5 mL于50 mL蒸餾水中，攪拌充分溶解，為反溶劑；稱取穿心蓮內(nèi)酯原料藥0.24 g，溶于2.5 mL二甲基亞砜中，攪拌均勻溶解，為溶劑相；在攪拌速率為1400 r/min條件下將溶劑相逐漸滴加到反溶劑相中，攪拌80 min，用0.8 μm微孔濾膜過濾，即得ANDRO-NS，采用BT-9300ST激光粒度分布儀和JEM2100透射電鏡對所制備的混懸劑的粒徑和結(jié)構(gòu)進(jìn)行評價。

1.6 穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑得率計(jì)算 取試驗(yàn)所制備的穿心蓮內(nèi)酯混懸劑，震蕩2 min，0.8 μm微孔濾膜過濾后，取下濾膜，干燥，稱量，計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的得率，其計(jì)算公式為：得率=(穿心蓮內(nèi)酯納米藥物量/穿心蓮內(nèi)酯藥物總量)×100%。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007整理并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定劑種類的選擇 試驗(yàn)分別考察了吐溫-80、F68、十二烷基硫酸鈉對穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯原料顆粒較大，呈團(tuán)塊狀(圖1)；單獨(dú)一種穩(wěn)定劑時，藥物結(jié)晶變?yōu)殚L條狀或者更小的棱形狀，但形狀大小分布極其不規(guī)則(圖2)，而使用F68和吐溫-80作為混合穩(wěn)定劑時，光鏡下觀察藥物形狀大小均一，分布均勻(圖3)，因此本試驗(yàn)確定F68混和吐溫-80為穩(wěn)定劑。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯原料藥結(jié)構(gòu)(×100)

圖2 F68對ANDRO-NS影響(×100)

圖3 混合穩(wěn)定劑對ANDRO-NS影響(×100)

2.2 穩(wěn)定劑濃度試驗(yàn)結(jié)果 由表2分析可知，當(dāng)吐溫-80濃度從0.6%升高到1.0%時，納米藥物得率增加到71.97%，當(dāng)其濃度為1.2%時，得率下降。因此選用吐溫-80的濃度為1%。

表2 穩(wěn)定劑濃度對穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的影響

2.3 藥物濃度試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知藥物濃度為40 mg/mL時得率最高，隨著藥物濃度增加，藥物顆粒碰撞的機(jī)會增加，易發(fā)生團(tuán)聚。因此本試驗(yàn)選用的藥物濃度為40 mg/mL。

表3 藥物濃度對穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的影響

2.4 反溶劑和溶劑體積比的篩選結(jié)果 根據(jù)表4可知，隨著反溶劑比例增加，納米藥物得率總體呈上升趨勢，反溶劑和溶劑的體積比為20時，觀察到的結(jié)晶外觀均為較小的球形顆粒且分布均勻，因此選擇反溶劑和溶劑的體積比為20有利于穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的制備。

表4 反溶劑和溶劑體積比對穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的影響

2.5 攪拌時間的篩選結(jié)果 由表5分析可知，攪拌時間為60 min時，藥物得率達(dá)到最高為76.62%，隨著時間的增加，得率呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，可能原因是混懸液中的微小顆粒不太穩(wěn)定，出現(xiàn)了聚集，但攪拌時間繼續(xù)延長，又會將體系中團(tuán)聚的顆粒分開。

2.6 攪拌速率的篩選結(jié)果 由表6分析可知，轉(zhuǎn)速為1200 r/min以下時得率平穩(wěn)，當(dāng)增加轉(zhuǎn)速時，得率也呈現(xiàn)增高趨勢。

表6 攪拌速率對穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的影響

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表7正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，以穿心蓮內(nèi)酯納米粒得率為指標(biāo)時，根據(jù)極差大小，其對影響因素為C>A>B>D，依據(jù)K值大小，其較優(yōu)條件為C2A2B1D1。結(jié)合單因素試驗(yàn)，最終確定反溶劑法制備穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的最佳工藝為：攪拌速率為1400 r/min、攪拌時間為80 min、藥物濃度為40 mg/mL、反溶劑和溶劑的體積比為20。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 按照上述正交試驗(yàn)所確定的較優(yōu)試驗(yàn)條件制備穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的粒徑大小見圖4，其平均粒徑為568.51±13.74 nm，得率為93.71%±1.84%。取適量穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑滴于銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸負(fù)染3 min，透射電鏡觀察見圖5。

圖4 ANDRO-NS粒徑圖

圖5 ANDRO-NS透射電鏡圖(×6000)

3 討論與結(jié)論

納米混懸劑是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，藥物的粒徑越小，其穩(wěn)定性相對也越差，容易出現(xiàn)沉降、聚集等現(xiàn)象，因此在制備過程中常需加入穩(wěn)定劑以解決其物理穩(wěn)定的問題。表面活性劑的種類和濃度對納米混懸劑穩(wěn)定性有顯著的影響，能夠與納米藥物快速形成穩(wěn)定粒子，降低粒子聚集和聚結(jié)的機(jī)率[11]。本試驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中單用泊洛沙姆時，所制得的混懸液極其不穩(wěn)定，放置24 h結(jié)晶就開始聚集變大，分析其中原因，可能是在形成ANDRO-NS時，上述單一穩(wěn)定劑不足以提供足夠的立體位阻和靜電排斥作用，致使析出的納米聚集增大，引起沉淀。據(jù)文獻(xiàn)報道，F(xiàn)68和吐溫-80屬于低粘度表面活性劑[12]，可以增加混懸液穩(wěn)定性，因此本試驗(yàn)選擇混合穩(wěn)定劑制備納米混懸劑。本試驗(yàn)考察了不同的吐溫-80濃度對結(jié)晶的影響，當(dāng)其為1%時，結(jié)晶外觀比較均一，當(dāng)繼續(xù)增加穩(wěn)定劑濃度，則納米粒穩(wěn)定性降低，其原因可能是由于穩(wěn)定劑濃度增大，多余的穩(wěn)定劑會自組裝形成膠束，引起膠束與納米粒表面競爭來吸附穩(wěn)定劑所致。因此選用吐溫-80及F68混合穩(wěn)定劑進(jìn)行后續(xù)研究。

反沉淀法制備的納米結(jié)晶的外觀及粒徑受到制備工藝多種因素的影響，例如藥物濃度、溶劑和反溶劑的體積比及攪拌速度等，因此需要優(yōu)化制備工藝。藥物濃度是影響納米混懸劑穩(wěn)定性的重要條件之一，藥物濃度過高，在反溶劑制備過程中過飽和程度更高，粒子成核迅速，生長快，但容易導(dǎo)致納米粒出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，而藥物濃度過低往往達(dá)不到用藥需求，所以在制備過程中要選擇適宜的藥物濃度，從而得到理想的納米粒子并且滿足用藥量[13]。本試驗(yàn)選擇藥物濃度40 mg/mL時得率最高，且粒徑穩(wěn)定。

攪拌速率、時間也是影響納米混懸液穩(wěn)定性重要條件之一。攪拌速率低，攪拌時間短，反應(yīng)不均勻，因而獲得的結(jié)晶較大、分布不均勻。攪拌速率升高，表面活性劑可以與藥物均勻混合，有利于獲得更小的結(jié)晶。李旺[14]采用反溶劑法聯(lián)合高壓均質(zhì)法制得牡荊干納米混懸劑，結(jié)果表明攪拌速率越高微粒趨向于更小，在1500 r/min時微粒最小，再增加速率，得率變化不明顯，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。此外，本試驗(yàn)對攪拌時間也進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示攪拌時間短，微粒的大小和形狀分布極其不均勻，可能是在攪拌短時間內(nèi)微粒的成核速率迅速增加，微粒的生長速率低，體系中的小顆粒增加，但隨著時間的延長，得率有高有低，因此攪拌時間可以根據(jù)其他因素的高低來選擇合適的時間。本試驗(yàn)結(jié)果表明在攪拌時間為80 min時，所制備的納米混懸劑的得率和外觀都較好，所以本試驗(yàn)最佳攪拌時間選為80 min。

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對穿心蓮內(nèi)酯納米混懸劑的處方工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，最優(yōu)處方工藝條件為: 以1%吐溫-80和0.05%泊洛沙姆為穩(wěn)定劑，藥物濃度為40 mg/mL，反溶劑和溶劑的體積比為20，攪拌速率為1400 r/min，攪拌時間為80 min，所制得的穿心蓮內(nèi)酯納米混懸液粒徑為568.51±13.74 nm。