孫 玥,周文忠

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 北京 100193)

固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanopartcles，SLN)是從20世紀(jì)開(kāi)始逐步發(fā)展起來(lái)的一種新型納米粒子載體[1]。SLN 采用固態(tài)的合成的或者天然的類脂作為脂質(zhì)材料，在乳化過(guò)程或乳化后可使蛋白以某種方式與脂質(zhì)納米相結(jié)合，其粒徑范圍一般在10～1000 nm。SLN擁有生理相容且耐受性好的特點(diǎn)，并且與傳統(tǒng)的藥物制劑相比具有較高的生物利用度[2-3]、增加藥物在體內(nèi)吸收和靶向性[4-5]、延緩藥物釋放度等優(yōu)點(diǎn)。

制備SLN的脂質(zhì)材料有許多種，由于飽和脂肪酸甘油酯、脂肪酸、混合脂質(zhì)等材料如：三酰甘油類如單硬脂酸甘油酯、三棕櫚酸甘油酯、二十二酸單、雙、三甘油酯混合物、三硬脂酸甘油酯；脂肪酸類如棕櫚酸、硬脂酸等；類固醇類如膽固醇等；蠟質(zhì)類如鯨蠟醇棕櫚酸酯、鯨蠟醇十六酸酯等。其中硬脂酸使用更頻繁，硬脂酸屬于長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸，是機(jī)體脂肪的重要組成成分和主要能量來(lái)源，理化性質(zhì)穩(wěn)定，在體內(nèi)可以降解，是一種理想的脂質(zhì)材料。此外在制備SLN時(shí)也可以混合加入幾種不同的脂質(zhì)材料，從而達(dá)到不同的制備目的如改變粒徑、電位等。

與其它納米載藥系統(tǒng)相比，SLN具有易于制備、成本低、可大規(guī)模生產(chǎn)、擁有良好的物理穩(wěn)定性、無(wú)有機(jī)溶劑的情況下SLN無(wú)脂質(zhì)載體系統(tǒng)的毒性等[6-7]。SLN已成為國(guó)內(nèi)外藥劑學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，如今已有SLN作為疫苗佐劑的相關(guān)研究，如Himanshu Mishraa等利用SLN呈遞乙肝病毒表面抗原[8]。

蛋白附著到納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單的物理吸附或更復(fù)雜的方法，例如：化學(xué)結(jié)合或包封實(shí)現(xiàn)。吸附通常是基于電荷或疏水作用[9]。包封，即在合成過(guò)程中蛋白與納米粒子在納米粒子制備過(guò)程中混合，蛋白進(jìn)入納米顆粒包封完成[10]，只有當(dāng)納米顆粒在體內(nèi)被分解時(shí)才被釋放。對(duì)于化學(xué)結(jié)合，是將蛋白化學(xué)交聯(lián)到納米粒子顆粒的表面[11]。表面吸附簡(jiǎn)單易行、使用方便、成本低，更適合于獸醫(yī)藥的應(yīng)用。

本文研究的固體脂質(zhì)納米擁有毒性低、制備簡(jiǎn)單、易工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，滿足獸醫(yī)藥領(lǐng)域的需求。實(shí)驗(yàn)用熱熔乳化超聲技術(shù)制備固體脂質(zhì)納米粒，研究納米粒理化性狀對(duì)吸附率影響因素，揭示影響固體脂質(zhì)納米粒吸附性的主要因素，為固體脂質(zhì)納米-蛋白載體的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 單甘脂、十四酸、考馬斯亮藍(lán)(G-250)購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限，聚乙烯醇(Poly vinyl alcohol, PVA)和BSA購(gòu)于 Sigma，雙十八烷基二甲基氯化銨(Dimethyldioctadecyl ammonium chloride, DDAC)購(gòu)于上海阿拉丁生化試劑有限公司。

1.2 固體脂質(zhì)納米粒制備 將1克脂質(zhì)材料放入50 mL離心管中，置于沸水浴中加熱使脂融化，再將融化的脂質(zhì)混合物置于55 ℃ 的水浴鍋中放置1～2 min。后加入10 mL在55 ℃ 水浴鍋中預(yù)熱的PVA溶液，使用細(xì)胞破碎儀(VC X 750 超聲波細(xì)胞破碎儀)直徑13 mm探頭，功率35%，超聲處理一定時(shí)間，分別加入10 mL冷卻水后搖勻成納米懸液。將各組固體脂質(zhì)納米懸液樣品分別取2 mL，14000 r/min離心40 min，收集沉淀后再將沉淀懸浮至2 mL水中重復(fù)離心一次，收集底部沉淀后將其置于凍干機(jī)于-49 ℃、1 Pa的條件下將水分抽干制成凍干粉，于置-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫拷M設(shè)置三個(gè)樣品。

1.3 粒徑、電位、多分散系數(shù)的檢測(cè) 利用光子相關(guān)譜法(PCS)檢測(cè)納米粒子的粒徑和分散度。分別取200 μL已制備好的固體脂質(zhì)納米懸液于4 mL離心管中，將檢測(cè)樣品稀釋12.5倍，在樣品池中加入1400 μL在25 ℃ 條件下用納米激光粒度儀ZS90(Malvern Instruments, UK)檢測(cè)納米粒子平均粒徑(mean diameter, MD)和多分散性系數(shù)(polydispersity index, PDI)。將上述檢測(cè)樣品繼續(xù)稀釋10倍，取800 μL加入到導(dǎo)電樣品池中檢測(cè)表面電位(zeta potential, ZP)。

1.4 Bradford法檢測(cè)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將10 mg/mL的BSA溶液用PBS稀釋得到濃度分別為100、80、60、40、20 μg/mL的溶液，取500 μL溶液分別與2 mL考馬斯亮藍(lán)混合反應(yīng)5 min后用分光光度計(jì)測(cè)定595 nm處吸光值。實(shí)驗(yàn)每組三個(gè)重復(fù)，然后以O(shè)D595的三次平均值做橫坐標(biāo)，BSA溶液的濃度做縱坐標(biāo)，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 吸附率檢測(cè) 稱取納米粒凍干粉12.5 mg，加入500 μg/mL的BSA至體積為250 μL。再加入生理鹽水至總體積為1 mL。將其置于離心機(jī)14000 r/min離心40 min，將上清液取出500 μL與2 mL配制好的考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng)，反應(yīng)5 min后在記錄595 nm處OD值，重復(fù)此操作直到上清液與考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)呈現(xiàn)陰性，將數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未被吸附的蛋白量，通過(guò)公式計(jì)算得出吸附率。

BSA吸附率={(加入總的蛋白量-未吸附的蛋白量)/ 加入的總蛋白量}×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 固體脂質(zhì)納米理化性狀 固體脂質(zhì)納米懸液外觀呈乳白色，無(wú)味；顆粒大小均勻，分散性良好，無(wú)沉淀。不同制備方案制備的固體脂質(zhì)納米粒平均粒徑(mean diameter, MD)、多分散性系數(shù)(polydispersity index, PDI)、表面電位(zeta potential, ZP)如表1所示。

表1 不同條件制備的固體脂質(zhì)納米粒理化性狀(mean±S.D.,n=3)

2.2 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線 Bradford法檢測(cè)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線BSA在1-100 μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， R2為0.9921。

2.3 不同脂質(zhì)材料納米粒吸附率比較 如圖1 所示，SLN1(單甘脂與十四酸)的吸附率顯著高于SLN5(氫化蓖麻油)固體脂質(zhì)納米粒的吸附率(P=0.023)。

2.4 不同表面電位納米粒吸附率的比較 由圖2可知，正電位SLN3(25.7±1.15 mV)的吸附率明顯高于負(fù)電位SLN1(-25.1±1.6 mV)(P=0.021)。

2.5 不同粒徑納米粒吸附率的比較 如圖3所示，不同粒徑的固體脂質(zhì)納米顆粒的吸附性比較結(jié)果為：SLN1(300±3 nm)分別與SLN2(100±5 nm)、SLN6(669±4 nm)相比差異性不顯著，但SLN2(100±5 nm)與SLN6(669±4 nm)相比較差異顯著(P=0.01)。

圖1 不同材料固體脂質(zhì)納米粒吸附率的比較

圖2 不同電位固體脂質(zhì)納米粒吸附率的比較

圖3 不同粒徑固體脂質(zhì)納米粒吸附率的比較

2.6 不同脂質(zhì)含量固體脂質(zhì)納米粒吸附率的比較如圖4所示，不同密度的納米懸液中脂質(zhì)含量不同吸附率也不同，濃縮組和正常組的吸附率無(wú)顯著差異，但稀釋組的吸附率與濃縮組和正常組有顯著差異，P值分別為0.028、0.027。

圖4 不同脂質(zhì)含量固體脂質(zhì)納米粒吸附率的比較

2.7 不同PVA濃度固體脂質(zhì)納米粒吸附率的比較 如圖5所示，不同PVA濃度乳化的固體脂質(zhì)納米粒吸附率比較結(jié)果為SLN2、SLN4無(wú)顯著差異。

圖5 不同PVA濃度固體脂質(zhì)納米粒吸附率的比較

3 討論與結(jié)論

研究固體脂質(zhì)納米粒吸附性的影響因素的目的是為了增加蛋白的表面吸附、減少劑量、降低成本或提高安全性。無(wú)論是真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞，納米粒子第一步都是先吸附后再通過(guò)其他途徑進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。通常正電位納米粒子與負(fù)電位納米粒子在靜電作用下更容易吸附到表面負(fù)電位的細(xì)菌或細(xì)胞表面。細(xì)胞對(duì)于納米粒子的粒徑也有著嚴(yán)格的控制如：DCs會(huì)優(yōu)先攝取病毒大小的顆粒粒徑約為20～200 nm，巨噬細(xì)胞則優(yōu)先攝取0.5～5 μm的顆粒[12]。

氫化蓖麻油的吸附性與單甘脂十四酸混合材料制備的固體脂質(zhì)納米粒有顯著差異。其原因可能是由于在相同質(zhì)量下十四酸的相對(duì)分子質(zhì)量為228，單甘脂為358.57。而HCO為938，相同質(zhì)量下十四酸和單甘脂的分子個(gè)數(shù)多于氫化蓖麻油，產(chǎn)生的氫鍵也多于氫化蓖麻油。因此，范德華力更強(qiáng)，且十四酸中含有的羧基與BSA產(chǎn)生的范德華力強(qiáng)于HCO中的羥基，十四酸和單甘脂與BSA的吸附更牢固，吸附率更高。

粒徑對(duì)于細(xì)胞攝取納米粒有著很重要的因素，其對(duì)于抗原的吸附率也會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響。為了制備不同的固體脂質(zhì)納米粒，將乳化時(shí)間延長(zhǎng)，制備了粒徑更小的納米粒。結(jié)果表明，將不同粒徑納米粒子的吸附性進(jìn)行檢測(cè)粒徑越小吸附性越高，但持續(xù)減小并無(wú)顯著差異。粒徑小吸附率高可能是由于小粒徑的比表面積(即單位質(zhì)量物料所具有的總面積)更大，與蛋白接觸機(jī)會(huì)多，使更易納米粒子結(jié)合。

為了制備表面電位為正的固體脂質(zhì)納米粒，在脂質(zhì)材料中加入了帶有陽(yáng)離子基團(tuán)的雙十八烷基二甲基氯化銨(DDAC)。DDAC的量要適當(dāng)，過(guò)多提高固體脂質(zhì)納米粒的表面電位可能會(huì)引起溶血等不良反應(yīng)[13]。將帶有正、負(fù)不同表面電位的固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行比較正電位的吸附率顯著高于負(fù)電位。BSA等電點(diǎn)為4.8，在中性溶液中帶負(fù)電，在靜電作用下更易與正電位的固體脂質(zhì)納米粒結(jié)合。

適宜的脂質(zhì)含量對(duì)制劑的使用也很重要，過(guò)多的脂質(zhì)材料注入機(jī)體可能會(huì)對(duì)注射部位產(chǎn)生不良反應(yīng)，對(duì)體內(nèi)的代謝、抗原的緩釋也有一定的影響[14]。本實(shí)驗(yàn)中，納米粒密度低時(shí)增加密度可以提高對(duì)蛋白的吸附率，這可能是由于納米粒對(duì)BSA的吸附達(dá)到飽和狀態(tài)，增加納米粒可以吸附游離的蛋白。而進(jìn)一步提高納米量卻沒(méi)有顯著增加吸附率，這可能由于游離的于吸附的BSA量達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，吸附率相對(duì)穩(wěn)定。

我們的前期研究顯示PVA濃度與SLN的粒徑、電位、分散系數(shù)、包封率等均有關(guān)系[15]，但本研究顯示PVA濃度對(duì)納米粒吸附率沒(méi)有明顯影響，對(duì)乳化后固體脂質(zhì)納米粒的狀態(tài)有一定影響。

固體脂質(zhì)納米粒對(duì)蛋白有普遍的吸附性，但影響吸附的因素很多，可針對(duì)不同蛋白通過(guò)改變材料、表面電位、粒徑、脂質(zhì)含量進(jìn)行優(yōu)化。

固體脂質(zhì)納米粒通過(guò)表面吸附作為蛋白載體在獸藥如疫苗有一定的實(shí)用性，通過(guò)納米粒制備組方優(yōu)化能夠更好地發(fā)揮納米載體的功效。