趙曉偉，李思源，肖智偉，李 軍，趙夢瑤，藺茹君，冀雪姣

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；3.中國人民解放軍69296部隊(duì)，新疆 喀什 844200)

食管癌位居全世界常見惡性腫瘤的第8位[1]。食管癌疾病進(jìn)展、術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后差的重要原因之一是食管癌侵襲及轉(zhuǎn)移[2]，探索抑制食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的方法是目前食管癌研究的熱點(diǎn)之一。COX-2在正常組織中表達(dá)幾乎為零，而在促癌因素、癌基因等病理因素刺激作用下，在局部組織中可迅速高表達(dá)[3-4]。COX-2主要是通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲[5]發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長作用。研究表明使用非甾體類消炎藥或特異性COX- 2抑制劑可抑制胃腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及生長活性[6]。MMP-14是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)中的一種，是以酶原形式由瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和分泌[7]的蛋白水解酶，經(jīng)水解后激活。MMP-14的過度表達(dá)，利于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，主要是通過破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障發(fā)揮作用[7-10]。在腫瘤細(xì)胞中MMP-14高表達(dá)，且癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移程度及腫瘤進(jìn)展與MMP-14的高表達(dá)密切相關(guān),是腫瘤患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)擬研究COX-2抑制劑塞來昔布對食管癌細(xì)胞系侵襲作用的影響及機(jī)制，為食管癌機(jī)制的研究及防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料：購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫的人食管癌EC109細(xì)胞系。購自美國pfizer pharmaceuticals LLC公司的塞來昔布。購自美國GIBCO公司的胎牛血清(FBS)、細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)。購自美國CORNING公司的Trans well小室(8 μm)。購自美國Becton Dickinson公司的基質(zhì)膠(Matrigel)。購自美國SIGMA公司的二甲基亞砜(DMSO)。購自美國SIGMA公司的結(jié)晶紫。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：在5% 二氧化碳恒溫37 ℃培養(yǎng)箱環(huán)境中，將人食管癌EC109細(xì)胞加入培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM)中培養(yǎng)，取其對數(shù)期細(xì)胞制備成105/ml的單細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組處理；以塞來昔布終濃度分組，分別為0 μmol/L、20 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L組。

1.2.3蛋白濃度測定：ELISA法測定塞來昔布(0 μmol/L、20 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L)作用下EC109細(xì)胞胞內(nèi)MMP-14蛋白的相對濃度。

1.2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：每個小室鏡下觀察可隨機(jī)選取5個視野計(jì)數(shù)，以穿過聚碳脂膜的細(xì)胞數(shù)目來評估食管癌EC109細(xì)胞侵襲能力。

2 結(jié)果

2.1EC109細(xì)胞在各塞來昔布組作用下的MMP-14蛋白相對濃度：EC109細(xì)胞被四組塞來昔布處理24 h后，ELISA測定EC109細(xì)胞內(nèi)的MMP-14蛋白表達(dá)水平，0 μmol/L塞來昔布組為11.517±0.881,20 μmol/L塞來昔布組為7.905±0.724,60 μmol/L塞來昔布組為5.788±0.750,100 μmol/L塞來昔布組為3.663±0.601，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；可見在0～100 μmol /L之間，隨著塞來昔布藥物濃度的遞增，細(xì)胞內(nèi)MMP-14蛋白表達(dá)逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 EC109細(xì)胞在各組塞來昔布作用下的MMP-14蛋白表達(dá)水平

注：與0 μmol/L塞來昔布組比較，*P<0.05

2.2EC109細(xì)胞侵襲能力在各塞來昔布組作用下的變化：各組塞來昔布處理EC109細(xì)胞24 h后， Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，穿過小室基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)，0 μmol/L組為258.200±16.991，20 μmol/L組為170.200±12.498，60 μmol/L組為85.600±8.905，100 μmol/L組為40.200±8.585，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=309.910，P<0.05)；可見隨著塞來昔布藥物濃度在0～100 μmol /L之間遞增，EC109細(xì)胞的侵襲能力逐漸降低。見圖2、圖3。

注：A：對照組；B：20 μmol/L塞來昔布組；C：60 μmol/L塞來昔布組；D：100 μmol/L塞來昔布組

3 討論

我國是食管癌新發(fā)病例數(shù)最多的國家[11]。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致食管癌惡化因素之一[2]。近來研究表明腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移與MMP-14在腫瘤組織中的高表達(dá)有相關(guān)性。MMP-14在多種腫瘤組織中，如胃癌[12-13]、結(jié)直腸癌[14-15]、原發(fā)性肝癌[16]、乳腺癌[17-18]、胰腺癌[19]等腫瘤組織均有過度表達(dá)，且MMP-14高表達(dá)的癌細(xì)胞侵襲能力與MMP-14非高表達(dá)相比增強(qiáng)。MMP-14是影響預(yù)后的重要因素[20]。

圖3 各塞來昔布處理組侵襲細(xì)胞的個數(shù)比較

COX-2是在炎性介質(zhì)[21]、多種促癌因素[22-23]等因素作用下高表達(dá)的誘導(dǎo)型酶。其主要是通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，對凋亡[2]有抑制作用。腫瘤組織中COX-2，MMP-14不僅均有高表達(dá)且兩者相關(guān)聯(lián)[24]，COX-2的高表達(dá)可同時(shí)伴有MMP-14蛋白表達(dá)的顯著增高，COX-2表達(dá)下調(diào)可使MMP-14蛋白表達(dá)降低，且腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力明顯降低[25-26]。劉衛(wèi)梅等研究表明在甲狀腺癌患者較甲狀腺良性病變中COX-2和MMP-14陽性表達(dá)率高，而兩者在甲狀腺體正常組織中不表達(dá)[24]。易松等在腎癌中的研究表明，組織中MMP-14高表達(dá)可能是促進(jìn)腎癌浸潤和轉(zhuǎn)移的因素之一[27]。

食管癌組織中COX-2存在持續(xù)性高表達(dá)。塞來昔布是選擇性 COX-2抑制劑，其發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用[28]，但具體的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)測定食管癌EC109細(xì)胞中MMP-14蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著塞來昔布藥物濃度遞增(在0～100 μmol/L之間)，細(xì)胞內(nèi)MMP-14蛋白相對濃度逐漸下降，說明COX-2可抑制MMP-14的表達(dá)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EC109細(xì)胞侵襲能力與塞來昔布呈濃度依賴性。說明MMP-14蛋白的高表達(dá)和食管鱗癌的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān),且呈負(fù)相關(guān)，MMP-14蛋白的高表達(dá)抑制食管鱗癌的浸潤轉(zhuǎn)移。因MMP-14和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，所以隨著COX-2抑制劑濃度的增加，癌細(xì)胞侵襲能力下降，筆者的研究結(jié)果就驗(yàn)證了這一點(diǎn)。 這與劉衛(wèi)梅[24]、易松[27]隨塞來昔布濃度增加MMP-14蛋白表達(dá)逐漸降低的結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明COX-2抑制劑塞來昔布通過抑制COX-2，降低EC109細(xì)胞內(nèi)MMP-14蛋白的表達(dá)，抑制EC109細(xì)胞侵襲。

綜上所述，本研究表明COX-2抑制劑塞來昔布可能通過抑制MMP-14蛋白表達(dá)，抑制食管癌EC109細(xì)胞的侵襲，這為食管癌的防治及靶向藥物的研制提供了依據(jù)。目前也有塞來昔布與常規(guī)化學(xué)治療藥物的聯(lián)合治療直腸癌[29]、口腔癌[30]、卵巢癌[31]、胃癌[32]等疾病在動物試驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中的研究，且目前可以被認(rèn)為是增強(qiáng)抗癌藥物的治療功效的藥物[33]，但機(jī)制尚不明確，仍需要在Bax基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，NF-κB信號通路的Cyclin D1靶基因,抑制腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤組織中血管形成及生長著過程等方面的研究 。目前也有些合成的MMP抑制劑應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，隨著研究的不斷深入，將會為腫瘤治療提供更多方法。