鄧澤 魯朝旭 袁姁 王馥云 余世東

摘 要：糞大腸菌群作為指示水體糞便污染的菌群，在環(huán)境監(jiān)測(cè)中是很重要的項(xiàng)目。本文通過對(duì)空白實(shí)驗(yàn)、陰陽(yáng)性對(duì)照、精密度、準(zhǔn)確度等試驗(yàn)，對(duì)新方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，并對(duì)不確定度、注意事項(xiàng)和優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行了探討，為多管發(fā)酵法測(cè)糞大腸菌群的準(zhǔn)確性提供一定參考和技術(shù)保障，希望能夠更好地服務(wù)于環(huán)境監(jiān)測(cè)工作。

關(guān)鍵詞：糞大腸菌群;多管發(fā)酵法;不確定度;方法驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：X832

糞大腸菌群在微生物項(xiàng)目中是總大腸菌群中的一部分，主要用來表明水質(zhì)受糞便污染的程度。糞大腸菌群是一類能使乳糖發(fā)酵、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，在44.5℃培養(yǎng)24～48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。水體糞大腸菌群含量的高低與周邊經(jīng)濟(jì)發(fā)展、企業(yè)影響、人口等因素密切相關(guān)，水體超標(biāo)會(huì)影響整個(gè)流域生態(tài)環(huán)境，對(duì)人體健康極為不利。通過對(duì)糞大腸菌群的監(jiān)測(cè)，可了解水體受生活污水污染的狀況。目前，WHO、ISO以及世界上絕大多數(shù)國(guó)家都以糞大腸菌作為水質(zhì)糞便污染指標(biāo)菌。糞大腸菌群適用于河流、湖泊等地表水、企業(yè)污水及醫(yī)院廢水的監(jiān)測(cè)，是綜合評(píng)價(jià)城鎮(zhèn)污水尤其是生活污水污染的一個(gè)必不可少的重要指標(biāo)[1-3]。

國(guó)際上測(cè)糞大腸菌群的實(shí)驗(yàn)方法主要有，多管發(fā)酵法、酶底物法、紙片法、濾膜法等，近幾年來，我國(guó)在糞大腸菌群的監(jiān)測(cè)方面取得了很大進(jìn)步，糞大腸菌群的相關(guān)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)也在不斷的更新。我國(guó)剛剛也出臺(tái)和變更了多管發(fā)酵法的新標(biāo)準(zhǔn)，酶底物法、多管發(fā)酵法等[1-2]。我國(guó)多用多管發(fā)酵法進(jìn)行檢測(cè)。

1 方法

1.1 監(jiān)測(cè)方法[2]

根據(jù)水樣的污染程度，選擇樣品的接種量。將樣品加入在含乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中（根據(jù)樣品濃度采取不同的培養(yǎng)試管或者三角燒瓶），在37±0.5℃培養(yǎng)箱里進(jìn)行初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)于產(chǎn)酸產(chǎn)氣的試管進(jìn)行復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，輕微振蕩試管，用接種環(huán)接種到裝有EC培養(yǎng)基的試管中，在44.5±0.5℃下進(jìn)行復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)，最后得出產(chǎn)氣的細(xì)菌為糞大腸菌群。

1.2 執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[3]

1.3 儀器和設(shè)備

（1）恒溫培養(yǎng)箱：37±0.5℃、44.5℃±0.5℃。

（2）高壓蒸汽滅菌器：121℃、101.3kPa。

（3）采樣瓶：500mL、250mL。

（4）移液管：1±0.01mL、10±0.1mL。

（5）試管：20mL、10mL

（6）接種環(huán)：直徑3mm。

1.4 試劑

EC培養(yǎng)基、單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、3倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基。

2 采樣

通過對(duì)南充市順慶區(qū)3條河流進(jìn)行采樣。用水樣采集器采集表層水，每件樣品量為500mL，裝入已經(jīng)滅菌處理的采樣瓶中，采集6個(gè)平行樣，并4℃以下冷藏保存。采樣瓶需用牛皮紙包扎滅菌[4]。

3 分析與討論

3.1 空白實(shí)驗(yàn)

每次試驗(yàn)均用無(wú)菌生理鹽水按照步驟進(jìn)行空白測(cè)定，培養(yǎng)后無(wú)任何顏色變化，測(cè)定結(jié)果均符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.2 陰陽(yáng)性對(duì)照

將糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)菌株制成一定濃度的菌懸液，分別取相應(yīng)水量的菌懸液按接種的要求接種于試管中，然后按實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)，陽(yáng)性菌株（大腸埃希氏菌）呈陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株（產(chǎn)氣腸桿菌）呈陰性反應(yīng)，該測(cè)定結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.3 精密度檢驗(yàn)

對(duì)三種濃度的水樣進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定，并計(jì)算其相對(duì)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，檢驗(yàn)該方法的精密度。從測(cè)定的結(jié)果得出，樣品1的測(cè)定均值為34.50MPN/L，樣品1取對(duì)數(shù)為154MPN/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.47%;樣品2的測(cè)定均值為7616.67MPN/L，樣品2取對(duì)數(shù)為3.88MPN/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.22%;樣品3的測(cè)定均值為12666.67MPN/L，樣品3取對(duì)數(shù)為4.1MPN/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.93%。以上樣品的精密度結(jié)果均符合驗(yàn)證要求具體測(cè)定結(jié)果見表2。

3.4 準(zhǔn)確度分析

根據(jù)多管發(fā)酵法有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試數(shù)據(jù)，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所測(cè)標(biāo)樣平均值為23MPN100m/L，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)真值為21±7MPN/100mL，可接受范圍為6-121MPN/100mL，相對(duì)誤差REi為1.0%。根據(jù)《水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法》（HJ347.2-2018）方法要求，準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證符合方法要求。

綜上所述，采用多管發(fā)酵法檢測(cè)水中的糞大腸菌群，對(duì)樣品進(jìn)行空白對(duì)照、陰陽(yáng)性對(duì)照、以及對(duì)精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果都在質(zhì)控范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室按照以上要求可獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，滿足其方法要求。

4 不確定度分析

影響糞大腸菌群MPN值計(jì)算結(jié)果不確定度的因素有很多，例如：培養(yǎng)基稱量配制過程的誤差、取樣稀釋過程引起的誤差、樣品保存條件、購(gòu)買培養(yǎng)基質(zhì)量的好壞、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、培養(yǎng)溫度的控制等[5-7]。

5 注意事項(xiàng)

（1）樣品采集時(shí)，可加入適量硫代硫酸鈉消除活性氯的干擾;如果確定水樣重金屬離子含量高的，可加入乙二胺四乙酸二鈉溶液消除干擾;采集樣品時(shí)，堅(jiān)持細(xì)菌樣優(yōu)先原則，盡可能直接采樣，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。

（2）樣品保存時(shí)，需要在10℃以下冷藏，6h內(nèi)完成測(cè)定。建議在采集細(xì)菌樣時(shí)，車上安裝車載冰箱或者其他冷藏設(shè)備，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)樣品溫度。

（3）樣品測(cè)試時(shí)，在樣品濃度比較低，易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果不明顯的發(fā)酵管，實(shí)驗(yàn)員應(yīng)將所有有可能的試管都進(jìn)行復(fù)發(fā)酵;初發(fā)酵24小時(shí)后未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣，可以適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間[6];培養(yǎng)基分裝滅菌時(shí)，排盡發(fā)酵管內(nèi)倒管中的氣泡，否則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;吸取不同濃度的稀釋液時(shí)，必須規(guī)范操作，及時(shí)更換移液管。

（4）定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陰陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，用無(wú)菌水做全程序空白和實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定。

（5）培養(yǎng)箱溫度的均勻性和穩(wěn)定性對(duì)多管發(fā)酵法的影響比較大，有條件最好放置精確的自動(dòng)記錄溫度儀實(shí)時(shí)監(jiān)控培養(yǎng)箱溫度[8]。

6 優(yōu)缺點(diǎn)

目前出臺(tái)的糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)。多管發(fā)酵法有著原理簡(jiǎn)單、技術(shù)難度容易、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度高、價(jià)格便宜、利于推廣的優(yōu)點(diǎn)，但操作步驟比較煩瑣、需要確認(rèn)實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)比較長(zhǎng)，檢測(cè)時(shí)間需要48～72小時(shí)，消耗大量人力、物力，不適于大批量樣品的分析[9]。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M].第四版.北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2003.

[2]國(guó)家生態(tài)環(huán)境部.水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法（HJ347.2-2018）[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[3]國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002）[M].中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)GB3838-2002.

[4]陳巧，李晉，李曉曼，袁姁.地表水采樣的質(zhì)量控制措施探討[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2020，（25）：119-123.

[5]何敏，張亞娟，周艷紅，等.水中糞大腸菌群檢測(cè)方法的對(duì)比[J].凈水技術(shù)，2018（09）：27-30.

[6]魯朝旭，袁姁，陳巧，李曉曼，梁時(shí)軍.糞大腸菌群監(jiān)測(cè)分析中存在的問題探討[J].綠色科技，2019，（14）：178-181.

[7]張貴剛，黃博珠.糞大腸菌群多管發(fā)酵法不確定度的評(píng)定[J].資源節(jié)約與環(huán)保，2018（8）：37，48.

[8]黎堯，張紹斌.多管發(fā)酵法測(cè)定水質(zhì)糞大腸菌群的探討[J].環(huán)境與發(fā)展，2019（5）：116.

[9]趙長(zhǎng)征.淺談水中糞大腸菌群檢測(cè)方法及其研究進(jìn)展[J].華東科技（綜合），2019（8）：0479-0480.

作者簡(jiǎn)介：鄧澤（1988— ），男，漢族，四川南充人，助理工程師，主要從事環(huán)境監(jiān)測(cè)分析與評(píng)價(jià)工作。

*通訊作者：袁姁（1995— ），女，漢族，重慶開州人，助理工程師，主要從事環(huán)境監(jiān)測(cè)分析與評(píng)價(jià)工作。