丁明寧，薛曉勇，李曉驕陽(yáng)

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029

類(lèi)器官是一類(lèi)由干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)生成，可高度模擬體內(nèi)組織和器官生物學(xué)特性的體外研究平臺(tái)，可應(yīng)用于不同組織和器官生理、病理及藥物作用過(guò)程的研究。目前有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC），包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human-induced pluripotent stem cell，iPSC），以及部分特定來(lái)源的成體干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)[1-2]，可形成具有特定組織功能的類(lèi)器官。這些類(lèi)器官在維持組織器官的功能和修復(fù)其損傷等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。相較于傳統(tǒng)研究中廣泛使用的永生細(xì)胞系和原代細(xì)胞，類(lèi)器官不僅具有細(xì)胞系增殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，而且其表型類(lèi)似于從體內(nèi)分離而來(lái)的不可增殖的原代細(xì)胞。同時(shí)，研究人員從健康人或病人身上獲取體細(xì)胞，通過(guò)不同的誘導(dǎo)分化方法，將其進(jìn)一步培養(yǎng)分化成為特定的類(lèi)器官，以更好地模擬器官的生物學(xué)功能。目前，已有腸道[3]、視網(wǎng)膜[4]、腦[5]、腎[6]、胰腺[7]和肺[8]等健康組織，甚至包括一些腫瘤組織[9]的類(lèi)器官被建立，這為基礎(chǔ)研究、新藥篩選及藥物開(kāi)發(fā)提供了更多體外研究平臺(tái)以供選擇。

肝臟作為人體眾多生理過(guò)程中的重要樞紐，在營(yíng)養(yǎng)素以及外源性物質(zhì)（如藥物）的代謝，膽汁酸、脂質(zhì)和膽固醇穩(wěn)態(tài)的維持，生長(zhǎng)信號(hào)通路的內(nèi)分泌調(diào)控，造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能的支持等生理活動(dòng)中意義重大[10]。肝臟由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞（如肝細(xì)胞）以及多種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（如膽管細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、肝臟巨噬細(xì)胞等）組成。過(guò)去的研究多基于細(xì)胞系進(jìn)行肝細(xì)胞體外研究，如可長(zhǎng)期擴(kuò)增的肝癌HepG2細(xì)胞，但其結(jié)果和體內(nèi)試驗(yàn)不能完全一致；部分正常人肝細(xì)胞系（如L02細(xì)胞等）已不推薦使用；原代肝細(xì)胞相對(duì)肝臟細(xì)胞系，可較好反映體內(nèi)肝細(xì)胞的實(shí)際功能，但其易凋亡且無(wú)法增殖，難以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)。雖然在3D膠原培養(yǎng)介質(zhì)上培養(yǎng)原代肝細(xì)胞可在一定程度上延長(zhǎng)其體外培養(yǎng)時(shí)間，但以上細(xì)胞模型僅涉及單一肝細(xì)胞，而忽視了肝臟中其他非實(shí)質(zhì)細(xì)胞所發(fā)揮的重要功能，如膽管細(xì)胞等。在肝臟病生理及藥理的體外研究中，不同于肝原代細(xì)胞模型，干細(xì)胞可通過(guò)多種途徑被誘導(dǎo)，在傳代后仍保持染色體穩(wěn)定的前提下，分化為細(xì)胞形態(tài)完整、功能完善的肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞，并逐步形成肝膽類(lèi)器官來(lái)模擬肝組織功能，解決了用原代肝細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)費(fèi)用較高，人肝組織難以獲取等問(wèn)題。

目前，藥物篩選和后續(xù)藥物體內(nèi)評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高，不利于藥物開(kāi)發(fā)的快速推進(jìn)。因此，類(lèi)器官作為一種可以有效評(píng)價(jià)藥物藥理毒理作用的體外細(xì)胞模型，受到了研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。近年來(lái)有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，中藥單體可在多種類(lèi)器官模型上進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)，Chen等[11]構(gòu)建了小腸類(lèi)器官，發(fā)現(xiàn)甘草次酸可通過(guò)提高人抗原R（human antigen R，HuR）以及下游增殖細(xì)胞核抗原Ki67（proliferation- associated nuclear antigen Ki67）的水平促進(jìn)小腸類(lèi)器官的發(fā)育，維持腸上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，利于藥物吸收。Li等[12]構(gòu)建了非小細(xì)胞性肺癌患者來(lái)源的肺癌類(lèi)器官，發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)人肺癌類(lèi)器官敏感，白屈菜紅堿、甜菜堿、斑蝥素對(duì)人肺癌類(lèi)器官有抗癌活性。由此可見(jiàn)，類(lèi)器官體外模型作為一種中藥藥物篩選及毒性評(píng)價(jià)平臺(tái)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。中醫(yī)認(rèn)為，肝乃將軍之官，具有生發(fā)，喜條達(dá)，惡抑郁，體陰而用陽(yáng)的功能特點(diǎn)；主筋而藏血，其華在爪，開(kāi)竅于目，主疏泄，并與膽相表里[13-14]。中藥藥效的發(fā)揮離不開(kāi)肝臟正常的生理功能，同時(shí)作為中藥主要的代謝器官，藥物的效毒作用也可影響肝臟的生理狀態(tài)。因此，應(yīng)用類(lèi)器官模型作為藥物篩選及臨床前評(píng)價(jià)平臺(tái)來(lái)考察藥物對(duì)肝臟的保護(hù)及毒性作用意義重大。肝膽類(lèi)器官模型作為一種肝臟系統(tǒng)的綜合評(píng)價(jià)體系，在評(píng)價(jià)中藥效毒作用方面具有天然的優(yōu)勢(shì)，該模型不僅可以模擬生理狀態(tài)下肝臟中多細(xì)胞間的相互作用，還可以通過(guò)現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，準(zhǔn)確、高效地反映藥物的作用機(jī)制，為新藥開(kāi)發(fā)、藥物評(píng)價(jià)及臨床用藥等提供新的策略方案。

1 不同來(lái)源肝或肝膽類(lèi)器官的分化過(guò)程

干細(xì)胞分化形成肝或肝膽類(lèi)器官通常需要以下4個(gè)步驟：內(nèi)胚層細(xì)胞的誘導(dǎo)、內(nèi)胚層向類(lèi)肝細(xì)胞分化、類(lèi)肝細(xì)胞的擴(kuò)增和成熟。先由干細(xì)胞誘導(dǎo)生成定型內(nèi)胚層細(xì)胞（definitive endoderm，DE），然后對(duì)DE進(jìn)一步的誘導(dǎo)，使細(xì)胞分化發(fā)育為肝母/肝祖細(xì)胞，肝母/祖細(xì)胞可進(jìn)一步增殖分化為成熟的類(lèi)肝細(xì)胞或類(lèi)膽管細(xì)胞，最后形成肝膽類(lèi)器官體系。用于肝膽類(lèi)器官分化研究的干細(xì)胞主要有ESC、iPSC以及成體干細(xì)胞，而不同來(lái)源的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過(guò)程略有差異。

ESC可進(jìn)行自我復(fù)制并能無(wú)限增殖，不同的研究人員利用這一特性對(duì)ESC進(jìn)行誘導(dǎo)分化，得到了肝類(lèi)器官和具有雙分化潛能的肝膽類(lèi)器官。Cai等[15]通過(guò)在培養(yǎng)基中加入激活素a（activin A，Act A），誘導(dǎo)ESC形成DE，隨后加入含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)gf4）和骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，Bmp2）的培養(yǎng)基，促進(jìn)DE向肝細(xì)胞分化，最后給予肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，Hgf）、抑癌蛋白M（oncostatin M，Osm）和地塞米松（dexamethasone，Dex）等因子促進(jìn)肝細(xì)胞的成熟。該細(xì)胞體外培養(yǎng)10 d后可表達(dá)人肝細(xì)胞的標(biāo)志物白蛋白（albumin，Alb）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，Afp）、角蛋白8（cytokeratin 8，CK8）、CK18等，并且在移植到四氯化碳肝損傷的小鼠體內(nèi)后，可表達(dá)人α-抗胰蛋白酶2周以上。此外，培養(yǎng)環(huán)境的變化也會(huì)影響肝膽類(lèi)器官的分化過(guò)程。早期研究多采用平面培養(yǎng)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)可以進(jìn)一步完善類(lèi)器官的功能并提高類(lèi)器官的肝分化成熟度。Ogawa等[16]發(fā)現(xiàn)通過(guò)3D培養(yǎng)和激活環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）通路可以促進(jìn)ESC誘導(dǎo)形成的肝母細(xì)胞向類(lèi)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且cAMP在分化早期通過(guò)內(nèi)胚層的激活素節(jié)點(diǎn)對(duì)肝母細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)。Rashidi等[17]發(fā)現(xiàn)采用2D培養(yǎng)誘導(dǎo)ESC得到的類(lèi)肝組織類(lèi)似于胚胎肝細(xì)胞，其肝臟特異性基因表達(dá)不穩(wěn)定，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較差。在應(yīng)用3D培養(yǎng)技術(shù)后，得到了穩(wěn)定表達(dá)肝臟特異性基因的3D肝類(lèi)器官，該類(lèi)器官不僅可以在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，還能促進(jìn)肝部分切除小鼠的肝功能恢復(fù)。相比2D培養(yǎng)，3D培養(yǎng)得到的類(lèi)器官更加成熟且功能穩(wěn)定。Wang等[18]通過(guò)Act A和MMTV整合位點(diǎn)家族成員3A（wingless-type MMTV integration site family,member 3A，Wnt3A）誘導(dǎo)ESC分化生成DE后，加入含Bmp4和Fgf4的培養(yǎng)基，在2D培養(yǎng)的條件下限制誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞譜系的細(xì)胞，并表達(dá)肝祖細(xì)胞的多個(gè)標(biāo)志物。另外，該研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)，這種肝膽類(lèi)器官不僅具有雙分化潛能，其中的單細(xì)胞還能重構(gòu)形成新的具有雙分化潛能的肝膽類(lèi)器官。

iPSC是由體細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞融合[19]、核移植[20]、多潛能因子表達(dá)[21]進(jìn)行重編程而成，類(lèi)似于ESC的干細(xì)胞[22]。Zhao等[23]從成人包皮提取出成纖維細(xì)胞用以誘導(dǎo)iPSC細(xì)胞，以堿性磷酸酶染色陽(yáng)性和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)陽(yáng)性為標(biāo)準(zhǔn)，鑒定由成纖維細(xì)胞重編程形成的iPSC細(xì)胞成功分化。一般來(lái)說(shuō)，iPSC可誘導(dǎo)分化為高純度的DE，并產(chǎn)生由多能干細(xì)胞衍生的單層肝細(xì)胞。Song 等[22]將含有八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor-4，Oct-4）、性別決定區(qū)Y框蛋白2（sex-determining region Y-box 2，Sox2）、Kruppel樣因子4（kruppel-like factor 4，Klf4）和未分化胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子1（undifferentiated embryonic cell transcription factor-1，Utf1）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到成人包皮提取出來(lái)的成纖維細(xì)胞中[23]，進(jìn)行體細(xì)胞重編程并建立iPSC細(xì)胞系。隨后他們首次在iPSC細(xì)胞分化的不同階段：內(nèi)胚層誘導(dǎo)（Act A）、肝分化（Fgf4、Bmp2）、肝母細(xì)胞增殖[Hgf、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，Kgf）]與肝成熟（Osm、Dex、N2B27）加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)iPSC分化生成肝樣細(xì)胞。但以上方法分化得到的肝樣細(xì)胞類(lèi)型單一，難以模擬肝臟中細(xì)胞和組織間復(fù)雜的信號(hào)通路。Vyas等[24]通過(guò)胚胎肝祖細(xì)胞和肝細(xì)胞外基質(zhì)共培養(yǎng)得到了具有膽管樣結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞，提出了多細(xì)胞共培養(yǎng)分化肝膽類(lèi)器官的研究方向。近年來(lái)也有研究采用了內(nèi)胚層細(xì)胞、上皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞祖細(xì)胞共同培養(yǎng)的方式，得到了功能更為完善的肝芽樣結(jié)構(gòu)[25]。Gieseck等[26]還發(fā)現(xiàn)通過(guò)3D培養(yǎng)和高通量篩選的方式，可提高iPSC所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的成熟度。通過(guò)對(duì)患者的體細(xì)胞進(jìn)行重編程形成iPSC，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯并移植到患者體內(nèi)后，可用于遺傳性疾病的治療，同時(shí)避免了倫理學(xué)爭(zhēng)議和排異反應(yīng)的發(fā)生[27]。Wu等[28]在最近的一項(xiàng)研究中，首次在不使用其他基因或外源性細(xì)胞的情況下，僅用含有25%的mTeSR的肝分化培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)胚層細(xì)胞和小部分中胚層細(xì)胞共同誘導(dǎo)的方式，將iPSC誘導(dǎo)形成具有肝膽功能的類(lèi)器官，且這種分化方式可推遲早期肝細(xì)胞分化，而在激活Notch2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，Tgf-β）信號(hào)通路后，可促進(jìn)iPSC向膽管細(xì)胞分化的過(guò)程。

此外，還有直接來(lái)源于肝膽細(xì)胞的類(lèi)器官。Sato等[29]發(fā)現(xiàn)提取自小腸隱窩的亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5+（leucine-rich repeat-containing G-protein- coupled receptor 5+，Lgr5+）的肝干細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)形成腸絨毛樣上皮所有類(lèi)型的細(xì)胞，形成具有層級(jí)結(jié)構(gòu)的Lgr5+腸上皮類(lèi)器官。隨后發(fā)現(xiàn)Lgr5+膽管來(lái)源的具有祖細(xì)胞潛能的肝干細(xì)胞不僅能在體內(nèi)外分化形成功能性肝細(xì)胞，還能在體外形成上皮類(lèi)器官[30]。

2 不同來(lái)源肝或肝膽類(lèi)器官的分化評(píng)價(jià)

在肝膽類(lèi)器官誘導(dǎo)形成的過(guò)程中，可在轉(zhuǎn)錄水平、細(xì)胞水平及功能水平上，通過(guò)檢測(cè)特異性基因的表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)及功能、移植后再生能力等方面對(duì)肝膽類(lèi)器官的分化效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。

無(wú)論是ESC、iPSC或肝膽細(xì)胞來(lái)源的肝或肝膽類(lèi)器官，在進(jìn)入肝分化誘導(dǎo)階段后，對(duì)類(lèi)器官形態(tài)和功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)相類(lèi)似。在分化的早期階段，通過(guò)定型內(nèi)胚層特異性蛋白叉頭框蛋白A2（forkhead box protein A2，F(xiàn)OXA2）和Sox17確定干細(xì)胞是否成功分化為DE；在肝分化誘導(dǎo)階段，可檢測(cè)肝細(xì)胞核受體4a（hepatocyte nuclear factor 4a，Hnf4a）、T-框轉(zhuǎn)錄因子3（T-box transcription factor 3，TBX3）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPA）、CEBPB、Sox9、CK19和鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CAM）等基因的表達(dá)，來(lái)確定肝細(xì)胞是否分化；在肝成熟和擴(kuò)增階段，通過(guò)檢測(cè)組成型雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）、法尼酯X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、孕甾烷X受體（pregnane and xenobiotic receptor，PXR）、細(xì)胞色素P450家族2亞家族C成員9（cytochrome P450 family 2 subfamily C member 9，CYP2C9）、CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1等特異性基因的表達(dá)，來(lái)判斷細(xì)胞是否被誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞。此外，原代肝細(xì)胞作為成熟肝細(xì)胞，其表達(dá)的多種藥物代謝標(biāo)志物(CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2A6、CYP2C8、CYP2C9和CYP2D6），常用以評(píng)估誘導(dǎo)分化所得的類(lèi)器官模型是否誘導(dǎo)為成熟的肝細(xì)胞。肝膽類(lèi)器官具有雙分化潛能，可分化成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞[31]，在檢測(cè)肝細(xì)胞特異性基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)膽管細(xì)胞標(biāo)志物如上皮黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（glutamine transferase，GGT）、水通道蛋白（aquaporin-2，AQP）、α1抗胰蛋白酶（alpha1-antitrypsin，AAT）、CK8、CK18和CK19、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如頂膜鈉依賴(lài)性膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT）、脂肪酸結(jié)合蛋白6（fatty acid binding protein 6，F(xiàn)ABP6）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance- associated protein，MRP3）和膽管細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如SOX9、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（hairy enhancer of split 1，HES1）、Hnf6和Hnf 1b的表達(dá)水平來(lái)確定肝膽類(lèi)器官中膽管細(xì)胞的功能水平和分化程度。在2D培養(yǎng)條件下，Wang等[18]在肝分化誘導(dǎo)階段使用了肝特異性培養(yǎng)基對(duì)DE進(jìn)行誘導(dǎo)，通過(guò)鑒定肝干/母細(xì)胞的特異性的基因表達(dá)（Hnf 4a、CK19、EPCAM、SOX9、Afp），確定類(lèi)器官成功進(jìn)行類(lèi)肝分化。為了確定類(lèi)器官的分化階段及并建立基因表達(dá)譜，從而建立類(lèi)器官發(fā)育階段的評(píng)價(jià)體系，研究人員對(duì)ESCs來(lái)源的肝系細(xì)胞、肝母細(xì)胞、成人肝細(xì)胞誘導(dǎo)形成的類(lèi)器官和人源胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的肝類(lèi)器官（human embryonic stem cell-derived expandable hepatic organoids，hEHO）進(jìn)行聚類(lèi)分析。研究發(fā)現(xiàn)所得hEHO會(huì)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子和早期肝臟發(fā)育調(diào)節(jié)因子如prospero相關(guān)盒蛋白1（prospero homeobox 1，PROX1）、單切域家族2（One cut domain family member 2，ONECUT2）、SOX9、FGF受體4（FGF receptor 4，F(xiàn)GFR4）、FOXA1和FOXA3；上調(diào)Wnt信號(hào)通路的成分如LGR5、鋅指蛋白3（zinc and ring finger 3，ZNRF3）、環(huán)指蛋白43（ring finger protein 43，RNF43）、AXIN2、CD44、dickkopf Wnt 信號(hào)通路抑制劑1（dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor 1，Dkk1）、Wnt7A和Wnt7B，并且肝母細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物（SOX9、EPCAM、CK19、Hnf4a、TBX3和Afp）呈陽(yáng)性，其多能標(biāo)志物有OCT4和SOX2則陰性表達(dá)。所以，根據(jù)該基因表達(dá)譜認(rèn)為hEHO的1～3代的表型類(lèi)似于新生階段的肝細(xì)胞：ESCs來(lái)源的肝系細(xì)胞和肝母細(xì)胞，具有肝干/母細(xì)胞的分化潛力，而hEHO移植進(jìn)免疫缺陷的老鼠的附睪后，能分化形成肝系的肝母細(xì)胞、成熟肝細(xì)胞和早期的膽管上皮細(xì)胞，且不會(huì)產(chǎn)生畸形瘤。

在誘導(dǎo)形成類(lèi)器官的過(guò)程中，還可以通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)來(lái)評(píng)估類(lèi)器官的分化效率。iPSC呈圓形克隆團(tuán)塊生長(zhǎng)，團(tuán)塊內(nèi)細(xì)胞形狀大小不一致[32]。在分化誘導(dǎo)后，會(huì)形成肝細(xì)胞樣粒狀上皮細(xì)胞和扁平胞質(zhì)透明細(xì)胞，再分化形成膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞[33]。肝膽類(lèi)器官中可觀(guān)察到具有多邊形輪廓、細(xì)胞質(zhì)空泡以及圓形細(xì)胞核的肝細(xì)胞，和空心囊狀或空心管樣結(jié)構(gòu)的膽管細(xì)胞。肝臟具有分泌和排泄膽汁，合成糖原、白蛋白及尿素等物質(zhì)，參與藥物代謝等重要功能，是維持人體正常生理循環(huán)和代謝的關(guān)鍵器官。因此，多數(shù)研究通過(guò)檢測(cè)白蛋白、尿素等的生成含量來(lái)評(píng)價(jià)肝膽類(lèi)器官的功能。此外，還可通過(guò)考察吲哚青綠染色來(lái)評(píng)價(jià)肝細(xì)胞的代謝能力，檢測(cè)CDFDA染料（被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2水解成CDF后產(chǎn)生熒光）產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)肝特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，基于PAS染色評(píng)價(jià)肝糖原的儲(chǔ)存能力等評(píng)價(jià)肝膽類(lèi)器官功能。近年來(lái)，也有學(xué)者[15]在肝類(lèi)器官培養(yǎng)的上清液中加入HIV-HCV假型病毒，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶含量確認(rèn)肝類(lèi)器官對(duì)丙肝病毒的易感性，用于考察肝類(lèi)器官的功能。

肝膽類(lèi)器官形成后可將其移植到小鼠體內(nèi)來(lái)評(píng)價(jià)其是否具備成熟肝膽細(xì)胞的功能。有研究表明，ESC細(xì)胞生成的類(lèi)器官移植入免疫缺陷的Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠體后，可以分化形成的成熟肝細(xì)胞來(lái)填充肝實(shí)質(zhì)，在移植到免疫缺陷小鼠的附睪后上沒(méi)有產(chǎn)生畸形瘤。若在該類(lèi)器官中加入人胚胎肝間充質(zhì)細(xì)胞，形成的衍生模型可用于模擬酒精性肝病，并在乙醇處理后可出現(xiàn)氧化應(yīng)激、單純脂肪變性、炎癥介質(zhì)釋放和肝纖維化等酒精性肝病相關(guān)的生理病理變化[18]。Rashidi等[17]將3D培養(yǎng)得到ESC源的肝類(lèi)器官移植到C57BL6/J小鼠，以及免疫缺陷的Rag2-/-IL2rg-/-小鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)接受移植的小鼠在手術(shù)2周后恢復(fù)到初始體質(zhì)量，同時(shí)檢測(cè)到人白蛋白的分泌，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）以及其他肝損傷標(biāo)志物表達(dá)的下降，證明了該類(lèi)器官具有成熟的肝組織功能。同時(shí)，該學(xué)者還采用具有良好耐受性和血管化的PCL電紡支架進(jìn)行研究，通過(guò)給小鼠皮下注射含肝類(lèi)器官的支架，發(fā)現(xiàn)小鼠肝損傷有所減輕。Takebe等[34]將3D培養(yǎng)下iPSC誘導(dǎo)的肝芽移植到先天免疫缺陷的小鼠體內(nèi)后，通過(guò)活體成像檢測(cè)到血流灌注功能的恢復(fù)以及其他肝功能逐漸完善。研究人員將Lgr5+的膽管細(xì)胞分化形成的肝膽類(lèi)器官移植到四氯化碳急性損傷的小鼠體內(nèi)，通過(guò)人特異性抗體檢測(cè)到人源CK19+的膽管樣細(xì)胞群和Alb+/CK19-肝細(xì)胞群[30]。

3 基于肝膽類(lèi)器官評(píng)價(jià)體系研究中藥的肝臟保護(hù)或損傷作用

隨著中藥在世界范圍內(nèi)的廣泛使用和深入研究，中藥肝保護(hù)及肝損傷作用受到廣泛的關(guān)注。類(lèi)器官作為一種由人干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的體外模型，可模擬人體器官發(fā)育的完整生物信息，還可用于研究疾病發(fā)生發(fā)展等病理過(guò)程，適用于中藥藥效學(xué)和毒理學(xué)評(píng)價(jià)、臨床前藥物篩選和早期毒性評(píng)估等。目前，關(guān)于中醫(yī)藥對(duì)肝膽類(lèi)器官的作用機(jī)制研究主要集中于中藥單體和多種天然藥物。

3.1 中藥在肝膽類(lèi)器官體系中保肝作用的研究

基于中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，從分子水平上精準(zhǔn)闡釋中藥復(fù)方多組分間藥效機(jī)制，有助于推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國(guó)際化發(fā)展。相關(guān)研究表明，保肝類(lèi)中藥具有提高類(lèi)器官活性及增殖能力等方面的潛力。目前，針對(duì)中藥促進(jìn)肝膽類(lèi)器官分化或成熟的研究較少?？紤]到膽固醇在肝臟膽汁酸合成中發(fā)揮的重要作用，有研究創(chuàng)新性地篩選了多種中藥活性成分，并與膽固醇按一定比例組合（即膽固醇＋專(zhuān)利中藥復(fù)方MIX）。結(jié)果顯示，不加膽固醇＋中藥MIX的肝膽類(lèi)器官在分化25 d時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡，其余的肝細(xì)胞則發(fā)生形態(tài)改變或者凋亡。而加入膽固醇＋中藥MIX后，類(lèi)器官的成熟肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增加，其培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)中藥復(fù)合物處理后的肝膽類(lèi)器官具有更好的藥物代謝能力、糖原儲(chǔ)存能力和Alb分泌能力，在體內(nèi)移植4周到8周后，膽固醇＋中藥MIX處理的肝膽類(lèi)器官可以在體內(nèi)存活更長(zhǎng)時(shí)間，并形成肝、膽細(xì)胞[28]。這一項(xiàng)研究提出了中藥復(fù)方及活性成分對(duì)肝膽類(lèi)器官的保護(hù)作用和潛在機(jī)制，為以后其他中藥藥物保肝研究指出了全新方向。

3.2 中藥在肝膽類(lèi)器官體系中毒性作用的研究

藥物肝毒性是藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中藥物安全性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，而肝膽類(lèi)器官培養(yǎng)不僅是一種新型的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，更具有成為臨床前藥物肝毒性評(píng)價(jià)模型的潛力。李朋彥等[33]采用3D培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)具有干性潛能的HepaRG細(xì)胞株，并誘導(dǎo)生成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽管細(xì)胞，同時(shí)基于此種培養(yǎng)模型體系進(jìn)行胺碘酮、環(huán)孢霉素的肝毒性評(píng)價(jià)。由于對(duì)中藥的不良反應(yīng)的忽略和不合理的超劑量濫用，中藥已經(jīng)成為我國(guó)藥物性肝損傷的首要原因[35-36]。隨著對(duì)中藥藥物作用機(jī)制研究的深入，如何合理評(píng)價(jià)中藥肝毒性成為亟需解決的科研問(wèn)題，闡釋中藥肝毒機(jī)制有助于提高中藥臨床用藥的安全性和合理性。目前，國(guó)內(nèi)已有肝損傷案例報(bào)道的中藥有雷公藤、何首烏、吳茱萸、千里光、柴胡等[37-38]，同時(shí)，常用的中藥肝毒性評(píng)價(jià)模型有原代肝細(xì)胞、動(dòng)物模型、類(lèi)器官等。人肝原代細(xì)胞常用于藥物肝毒性評(píng)價(jià)，但其無(wú)法增殖、存活時(shí)間短并且獲取及培養(yǎng)成本較高；而動(dòng)物模型由于種屬差異，不能完全模擬中藥在人體內(nèi)的效毒作用，同時(shí)有研究表明動(dòng)物對(duì)藥物毒性有更高的耐受性，影響了臨床前藥物評(píng)估實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度[39]。人源干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝膽類(lèi)器官可大量增殖并實(shí)現(xiàn)體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，且生物學(xué)特性均類(lèi)似于肝原代細(xì)胞，同時(shí)評(píng)價(jià)效率高，適用于急、慢性藥物的藥理及毒理評(píng)價(jià)。

肝膽類(lèi)器官可用于中藥成分低濃度、長(zhǎng)時(shí)間暴露所產(chǎn)生的肝毒性評(píng)價(jià)和機(jī)制研究。Kang等[40]利用胚胎干細(xì)胞QIA7和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞WA01誘導(dǎo)的肝細(xì)胞評(píng)價(jià)乙酰氨基酚和黃曲霉素B2的肝毒性。通過(guò)多參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，給予對(duì)乙酰氨基酚和黃曲霉素B2后，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成的肝細(xì)胞和肝原代細(xì)胞，在線(xiàn)粒體膜電位、鈣內(nèi)流和氧化應(yīng)激的表型變化相似。李婷婷等[41]發(fā)現(xiàn)何首烏的主要活性成分為反式二苯乙烯苷（trans-SG），其體內(nèi)造成肝損傷的主要物質(zhì)為順式二苯乙烯苷（cis-SG），采用液滴重疊法對(duì)具有干性的HepG2和L02細(xì)胞系進(jìn)行3D培養(yǎng)得到肝類(lèi)器官，在此肝類(lèi)器官體系下驗(yàn)證了cis-SG的肝損傷作用顯著高于trans-SG，同時(shí)發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)的類(lèi)器官模型在重復(fù)給藥后，對(duì)藥物毒性敏感性增加，符合中藥肝損傷的特點(diǎn)。胡秋艷[32]采用iPSC誘導(dǎo)的肝類(lèi)器官作為評(píng)價(jià)藥物肝毒性的模型，發(fā)現(xiàn)該模型可以很好評(píng)價(jià)雷公藤的肝毒性作用：雷公藤凍干粉的劑量與肝細(xì)胞損傷標(biāo)志物谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、AST及肝細(xì)胞膜損傷標(biāo)志物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的活性均具有一定正相關(guān)性，同時(shí)，也與抗氧化還原酶谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性具有一定的負(fù)相關(guān)性，以上雷公藤凍干粉的結(jié)果在L02細(xì)胞中得到驗(yàn)證，說(shuō)明了iPSC誘導(dǎo)的類(lèi)器官具有評(píng)價(jià)中藥肝毒性的潛能。Kim等[42]基于流式細(xì)胞分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)采用2個(gè)hESC細(xì)胞系BG01和SNUhES4誘導(dǎo)形成肝膽類(lèi)器官98%為肝細(xì)胞（Alb+、HNF4a+）和2%為膽管細(xì)胞（EpCAM+、CK7+）。隨后通過(guò)細(xì)胞增殖能力檢測(cè)和生理功能分析 [PAS糖原染色、吲哚菁綠（indocyanine green，IGG）攝取能力、低密度脂蛋白攝取能力] 等方面對(duì)此肝類(lèi)器官進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其各項(xiàng)生理功能均與原代肝細(xì)胞類(lèi)似。在類(lèi)器官模型建立后，給予參照藥物曲格列酮和二甲雙胍，其細(xì)胞存活率變化趨勢(shì)類(lèi)似于原代肝細(xì)胞。隨后采用肝膽類(lèi)器官、人源原代肝細(xì)胞以及HepG2細(xì)胞3個(gè)體外評(píng)價(jià)平臺(tái)對(duì)白術(shù)苷、大黃素、黃獨(dú)乙素和沒(méi)食子酸的肝細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，3個(gè)體外評(píng)價(jià)系統(tǒng)均顯示黃獨(dú)乙素不具有肝細(xì)胞毒性；顯示白術(shù)苷對(duì)HepG2細(xì)胞具細(xì)胞毒性，而對(duì)肝原代細(xì)胞和肝類(lèi)器官模型則不具有細(xì)胞毒性；顯示大黃素和沒(méi)食子酸僅對(duì)HepG2細(xì)胞有細(xì)胞毒性。以上研究證明了肝膽類(lèi)器官對(duì)藥物毒性的評(píng)價(jià)效果類(lèi)似于肝原代細(xì)胞且優(yōu)于HepG2細(xì)胞，更適用于臨床前藥物篩選和藥物評(píng)價(jià)。

4 結(jié)語(yǔ)

由于肝膽類(lèi)器官可高度模擬體內(nèi)組織、器官的功能結(jié)構(gòu)和遺傳特征等生物學(xué)特性，在中醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的研究前景。目前研究表明，3D培養(yǎng)技術(shù)[16]的應(yīng)用或特殊內(nèi)源性小分子物質(zhì)[28]的加入，可能會(huì)促進(jìn)肝膽類(lèi)器官的成熟分化；通過(guò)對(duì)多胚層、不同來(lái)源的類(lèi)器官或類(lèi)器官與其他細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，如共培養(yǎng)干細(xì)胞誘導(dǎo)而成的不同胚層的細(xì)胞[29]，共培養(yǎng)心肝腎3種來(lái)源的類(lèi)器官[43]，共培養(yǎng)iPSC誘導(dǎo)形成的肝星狀細(xì)胞和HepaRG細(xì)胞[44-45]，可提高類(lèi)器官的誘導(dǎo)效率，并用于研究多細(xì)胞間交流及疾病機(jī)制。復(fù)方中藥、單味中藥與中藥單體相比，在肝毒性機(jī)制研究上更為復(fù)雜，需根據(jù)臨床實(shí)際用藥的情況，基于中藥復(fù)方進(jìn)行藥效毒性的精準(zhǔn)評(píng)價(jià)。而肝膽類(lèi)器官體外培養(yǎng)平臺(tái)與大規(guī)模篩選系統(tǒng)的聯(lián)用，有望成為一種高精度、高靈敏度的中藥體外篩選平臺(tái)和肝毒性評(píng)價(jià)平臺(tái)。隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展和體內(nèi)外研究的不斷完善，肝膽類(lèi)器官將為相關(guān)肝膽疾病的臨床治療提供有利條件。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突