尚千涵，高其媛，楊 婷，梁 健，王 樂，灑 威,3*，王瑪麗，申智清，李忠虎

1.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016

2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，陜西 西安 710069

3.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016

4.青海省海東市平安區(qū)小峽鎮(zhèn)人民政府，青海 海東 810600

羊肚菌Morchella esculentaL.隸屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬MorchellaDill.ex Pers.，是一種喜低溫環(huán)境的藥食兩用真菌。羊肚菌屬物種廣泛分布于北半球溫帶地區(qū)，中國是該屬的物種多樣性中心和分化分布中心[1]。近年來，學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌不僅味道鮮美，還具有極高的營養(yǎng)價值，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)及豐富的脂肪酸等[2-4]。作為一種重要的藥用真菌，羊肚菌具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化以及增強人體免疫力等一系列保健功效[5-11]。然而近年來由于全球氣候變化，導(dǎo)致羊肚菌屬物種的棲息地破碎和片段化，加上消費者對于羊肚菌美食的喜愛，過渡采挖造成羊肚菌屬野生資源急劇減少，因此，亟需對羊肚菌屬物種資源進行保護。生物類群的遺傳多樣性分布模式和進化特征，對于生物資源的保護非常重要。本文從羊肚菌屬的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和家系關(guān)系以及基因組進化等的研究進展進行綜述，以期為羊肚菌屬資源的科學(xué)保護提供重要依據(jù)。

1 羊肚菌屬的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)和重要組成部分，關(guān)系到一個物種或類群的進化潛力和未來命運。一般來說，遺傳多樣性高的物種或群體，更能抵御未來環(huán)境變化或病蟲害的侵襲，具有更強的適應(yīng)能力。近年來，大量分子標記技術(shù)開發(fā)被應(yīng)用于羊肚菌屬類群的多樣性水平研究。Du等[12]基于梯棱羊肚菌M.importunaM.Kuo,O'Donnell & T.J.Volk的基因組序列，首次開發(fā)該物種的基因組微衛(wèi)星分子標記，發(fā)現(xiàn)梯棱羊肚菌基因組中共含有12 902個簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR），其中單核苷酸重復(fù)（66.2%）是最常見的基序。隨后他們利用其中22個多態(tài)性的SSRs標記對梯棱羊肚菌及其近緣種進行多樣性分析，在梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌M.sextelataM.Kuo、七妹羊肚菌M.eximiaBoud.、頭絲羊肚菌M.exuberansClowez,Hugh Sm.& S.Sm.、Mel-13和Mel-21等羊肚菌近緣物種中檢測到了15～20個多態(tài)性位點，進化分析推測羊肚菌屬內(nèi)發(fā)生的種間雜交事件導(dǎo)致了該類群具有較高水平的遺傳多樣性。趙永昌等[13]運用隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）標記技術(shù)對分布于我國滇西北地區(qū)的3種羊肚菌群體樣本進行分析，共產(chǎn)生了243個位點的多態(tài)性變異。陳立佼等[14]利用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分子標記技術(shù)對49個單孢栽培的尖頂羊肚菌進行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)該物種單孢之間具有很高的遺傳多態(tài)性。曹君等[15]應(yīng)用簡單重復(fù)序列區(qū)間（inter-simple sequence repeat，ISSR）標記技術(shù)分析了中國遼寧地區(qū)15株栽培羊肚菌和14株野生羊肚菌樣品的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)野生羊肚菌品種與栽培品種具有明顯的遺傳差異性。武冬梅[16]進一步運用ISSR分子標記技術(shù)對我國新疆地區(qū)25個野生羊肚菌自然群體展開多樣性研究，發(fā)現(xiàn)群體間遺傳變異存在顯著差異，遺傳多樣性較高的群體大多生長于環(huán)境條件良好的地區(qū)。

近年來，基于Sanger測序技術(shù)的分子生物學(xué)技術(shù)也運用到了羊肚菌類群多樣性的檢測中。Du等[17]基于基因間隔序列（intergenic transcribed spacer，ITS）片段對2個親緣關(guān)系較密切的同域分布羊肚菌進行群體間多樣性研究，發(fā)現(xiàn)三地羊肚菌M.eohesperaBeug,Voitk & O'Donnell比Mel-13具有更高水平的遺傳變異，推測2個物種間普遍存在的克隆繁殖、局部重組和潛在雜交或水平基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了它們之間差異化的遺傳多態(tài)性模式。劉偉等[18]對采自全國12個省份的36個羊肚菌栽培菌株進行ITS序列變異分析，發(fā)現(xiàn)供試菌株梯棱羊肚菌種內(nèi)的多態(tài)性明顯高于六妹羊肚菌。Pagliaccia等[19]利用單核苷酸多態(tài)性-序列特異性擴增區(qū)（single nucleotide polymorphism-sequence characterized amplified regions，SNP-SCAR）和AFLP相結(jié)合技術(shù)對皺柄羊肚菌M.snyderiM.Kuo & Methven的單孢進行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)單孢之間存在重組現(xiàn)象，從而推測其生殖方式可能為異宗配合。杜習(xí)慧[20]檢測了梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌的栽培和野生品種子實體的交配型基因分布差異，發(fā)現(xiàn)構(gòu)成栽培種和野生種的子實體交配類型截然不同。此外，Du等[21]基于交配基因MAT1-1-1和MAT1-2-1對梯棱羊肚菌等14種黑色羊肚菌進行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)2種基因型的地理分布在自然群體中存在顯著差異。

以上這些研究利用早期開發(fā)的基于聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的分子標記或基于一代DNA測序技術(shù)對羊肚菌不同類群進行遺傳多樣性檢測，發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬物種具有較高水平的遺傳多樣性。然而，這些研究僅局限于利用某種特定的分子標記或?qū)Ψ植加谔囟▍^(qū)域的羊肚菌類群進行研究，不能準確地揭示羊肚菌屬物種的真實多樣性水平。今后需采用多個不同遺傳背景的分子標記，如單親遺傳的線粒體DNA標記和雙親遺傳的核基因分子標記相結(jié)合的方法，并利用現(xiàn)代群體遺傳學(xué)中最新開發(fā)的一系列新的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法，如基于Bayesian原理的群體結(jié)構(gòu)和變異檢測法，對羊肚菌屬類群進行準確的遺傳多樣性研究。

2 羊肚菌屬的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系

遺傳結(jié)構(gòu)是遺傳變異在時間和空間上的演化和分布模式，受到地質(zhì)氣候波動、基因流、隔離擴散及生物繁殖系統(tǒng)因素的影響。一般來說，一個物種或群體的遺傳結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，其適應(yīng)性越強。近年來，學(xué)者對羊肚菌屬的遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳關(guān)系進行了研究，推測羊肚菌屬的起源和進化歷史。Du等[17]對同域分布的三地羊肚菌和Mel-13進行遺傳結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬內(nèi)不同物種間的近交繁殖和雜交漸滲，導(dǎo)致了2個親緣關(guān)系較近的物種呈現(xiàn)出不同的演化歷史和遺傳分化模式。武冬梅[16]對我國新疆地區(qū)的野生羊肚菌群體進行了遺傳結(jié)構(gòu)研究，發(fā)現(xiàn)該物種遺傳變異主要存在于群體內(nèi)；群體間存在一定程度的遺傳分化，物種經(jīng)歷了有限的交流或短距離的移動等過程。劉文叢等[22]利用ISSR標記方法對我國滇西北地區(qū)11個群體56個羊肚菌子實體進行了遺傳結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)群體間的遺傳分化明顯大于群體內(nèi)。魏巍等[23]采用ISSR分子標記技術(shù)，對16株野生羊肚菌進行了遺傳差異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試羊肚菌菌株能夠明顯劃分為遺傳背景上存在差異的2組。Dalgleish等[24]利用RAPD技術(shù)對相對距離較近的3個地點57個羊肚菌M.esculenta(L.) Pers子實體進行研究，發(fā)現(xiàn)群體間存在明顯的遺傳分化，推測可能是同一地點的菌株間比不同地點的菌株間發(fā)生了更為頻繁的近親繁殖。

近年來，學(xué)者基于DNA分子測序技術(shù)結(jié)合其他分析手段對羊肚菌屬類群的進化關(guān)系作了大量研究。劉娜等[25]基于ITS序列分析技術(shù)結(jié)合同工酶測試手段對人工栽培梯棱羊肚菌菌株間的遺傳特性和親緣關(guān)系進行研究，同工酶分析發(fā)現(xiàn)，供試菌株間存在一定程度的遺傳差異；拮抗試驗結(jié)果顯示，待測菌株間的親緣關(guān)系較近，遺傳背景差異較小。陳立佼等[14]分析了單孢尖頂羊肚菌形態(tài)與遺傳特征的對應(yīng)趨勢，聚類分析將其分為11個組群，與形態(tài)分組較為一致。楊燕等[26]對采自我國四川、湖北、陜西的14個人工栽培羊肚菌和4個野生羊肚菌進行遺傳變異特征分析，聚類結(jié)果顯示，在相似系數(shù)為0.54時可將其分為2大類，菌株間具有明顯的遺傳差異。Ta?kin等[27]對土耳其南部和愛琴海地區(qū)分布的247個羊肚菌標本進行初步篩選，并基于系譜一致性的多基因系統(tǒng)發(fā)育進行物種聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，極少數(shù)物種聚類于Esculenta分支，更加適應(yīng)于北溫帶環(huán)境；而土耳其分布的物種呈現(xiàn)出較高的地方特有性，推測為局地適應(yīng)所致。

Singh等[28]比較分析了ITS和RAPD標記區(qū)分羊肚菌屬遺傳關(guān)系的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種標記在不同地理區(qū)域的羊肚菌單孢子種內(nèi)水平上的分析結(jié)果較為一致。Phanpadith等[29]采用系譜一致性系統(tǒng)發(fā)育識別（genealogical concordance phylogenetic species recognition，GCPSR）法對我國秦嶺地區(qū)分布的38個羊肚菌菌絲體無性系進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試標本可分為5個系統(tǒng)發(fā)育分支。Pilz等[30]利用RAPD技術(shù)分析了251個羊肚菌樣本的遺傳結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果顯示北美羊肚菌呈現(xiàn)出獨立的3大進化分支，并存在較高的支持率。王龍等[31]對甘肅分布的16份野生羊肚菌進行ITS序列分析，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，供試羊肚菌樣品主要歸類于黃色羊肚菌支系和黑色羊肚菌支系。O'Donnell等[32]以LSU、EF1-n、RPB1、RPB2基因建立系統(tǒng)發(fā)育樹，分支分析鑒定了羊肚菌屬的3個譜系分別為變紅羊肚菌、黑色羊肚菌和黃色羊肚菌支系。沈洪等[33]進一步采用ITS序列對14個羊肚菌子實體進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)以鐘菌屬為外類群，聚類為3大支系，并發(fā)現(xiàn)黑脈羊肚菌、高羊肚菌和尖頂羊肚菌的序列高度相似。Chai等[34]以17種羊肚菌的42份標本為研究材料，利用MAT1-1-1和MAT1-2-1基因建立交配基因系譜，與多位點系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果比較顯示，拓撲結(jié)構(gòu)在黑色羊肚菌分支內(nèi)高度一致，而在黃色羊肚菌分支內(nèi)分支順序和姊妹群關(guān)系略有差異。Pildain等[35]對南美洲收集的65個羊肚菌菌株進行系統(tǒng)發(fā)育研究，發(fā)現(xiàn)供試羊肚菌樣本均屬于黑色羊肚菌分支，并由M.frustrataM.Kuo、M.septimelataM.Kuo和阿根廷新系譜種Mel-37組成。杜習(xí)慧等[1]采集我國各省份的羊肚菌屬900余份材料，利用ITS、LSU、EF1、RPB1、RPB2等多基因聯(lián)合分析法，對供試材料進行分子系統(tǒng)學(xué)和生物地理學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羊肚菌屬包含61個系統(tǒng)發(fā)育物種，并由3個支系（黑脈羊肚菌、高羊肚菌和尖頂羊肚菌）構(gòu)成，同時推測東亞或中國是羊肚菌屬的現(xiàn)代物種多樣性中心。

研究表明，羊肚菌屬類群具有差異化的變異模式，表現(xiàn)出群體間遺傳變異高于群體內(nèi)的特性。推測物種的繁殖系統(tǒng)，如孢子的傳播距離、傳播方式及異宗配合可能導(dǎo)致羊肚菌屬物種差異化的遺傳分化格局和遺傳關(guān)系。

3 羊肚菌屬的線粒體基因組進化

線粒體是細胞物質(zhì)氧化和能量供給的場所，具有獨立的遺傳系統(tǒng)。線粒體基因組在大部分植物中具有小型基因組、母系遺傳、變異率低及進化速率慢等特點。線粒體基因組的長度多態(tài)性、高辨識度使其可能成為一種新型的分子標記。研究表明，線粒體DNA作為食用真菌的唯一核外遺傳物質(zhì)，已成為物種鑒別、起源和進化研究的理想工具[36-38]。近年來，在美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中記錄的完整絲狀真菌線粒體基因組的數(shù)量顯著增加，而對于羊肚菌屬物種的線粒體基因組報道甚少，僅見梯棱羊肚菌和粗柄羊肚菌M.crassipes(Vent.) Pers.的線粒體基因組序列報道[39-40]。Liu等[39-40]采用基因延伸策略組裝和注釋梯棱羊肚菌和粗柄羊肚菌的線粒體基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)梯棱羊肚菌和粗柄羊肚菌的線粒體全基因組大小分別為272 238、531 195 bp，均具有明顯的環(huán)狀分子特征，存在大量的重復(fù)序列和眾多的非開放閱讀框（non-conserved open reading frames，ncORFs）。序列分析進一步發(fā)現(xiàn)，眾多的ncORFs在梯棱羊肚菌的線粒體基因組中大量表達，有些ncORFs的表達水平甚至超過了大核糖體RNA亞基的表達。

研究表明，梯棱羊肚菌和粗柄羊肚菌的線粒體基因組是目前真菌中發(fā)現(xiàn)最大的線粒體基因組，它們存在大量的ncORFs、高含量的內(nèi)含子和高度的內(nèi)部重復(fù)序列等特征[39-40]。研究表明，基因間隔區(qū)、重復(fù)序列、可移動遺傳因子及水平基因轉(zhuǎn)移可能導(dǎo)致真菌線粒體基因組大小存在差異[41]。其中，基因間隔區(qū)序列長度的變化能夠改變基因組的大小；基因組內(nèi)的重復(fù)序列可能發(fā)生重組從而對基因組產(chǎn)生影響；可移動遺傳因子包含有內(nèi)含子大小、數(shù)量的變化以及線粒體質(zhì)粒整合，使線粒體基因組呈現(xiàn)不同的大小變化；水平基因轉(zhuǎn)移包含內(nèi)含子歸巢、線粒體質(zhì)粒整合、核基因與線粒體基因之間遺傳物質(zhì)交換、tRNA介導(dǎo)[42]及質(zhì)粒介導(dǎo)[43]的水平基因轉(zhuǎn)移等。Liu等[39-40]對羊肚菌屬不同物種的線粒體基因組進一步分析，發(fā)現(xiàn)它們均存在大量的重復(fù)序列，梯棱羊肚菌的重復(fù)序列約為18%，而粗柄羊肚菌的重復(fù)序列高達272 544 bp，約占線粒體基因組的51.31%。一般來說，大量重復(fù)序列的出現(xiàn)是進化的必然結(jié)果，在進化過程中遺傳物質(zhì)不斷進行自我復(fù)制，同時相互之間進行著水平交換、垂直交換，極大地擴增和豐富了遺傳信息，從而表現(xiàn)出物種之間的遺傳多樣性和變異[44]。

此外，復(fù)制事件在基因組塑造過程中起到重要作用，可能是創(chuàng)造遺傳新性狀的基礎(chǔ)。Liu等[39-40]研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌屬線粒體基因組存在大量的內(nèi)含子，內(nèi)含子作為自私遺傳因子，可以隨意在基因組中插入和丟失，造成線粒體基因組大小迥異；也可能是內(nèi)含子ncORFs編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸內(nèi)切酶使線粒體基因擴增，逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸內(nèi)切酶擁有移動基因組和增加拷貝數(shù)量的能力，導(dǎo)致重復(fù)序列和基因組大小的不同[45]。這些事件的發(fā)生都有可能促使線粒體基因組的大小差異，使線粒體基因組呈現(xiàn)多樣化。

目前，對羊肚菌屬物種線粒體基因組的研究相對較少。此外，在真菌線粒體基因組中普遍存在水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[46]，但在羊肚菌屬物種線粒體基因組中，是否發(fā)生過基因間的水平轉(zhuǎn)移，是否存在核基因與線粒體基因之間遺傳物質(zhì)的交流有待進一步深入分析和研究。

4 羊肚菌屬的全基因組進化

基因組測序是一種高通量獲取遺傳信息的技術(shù)手段，已廣泛應(yīng)用于羊肚菌屬物種研究中。Liu等[47]對梯棱羊肚菌M04菌株中分離到的2個具有不同交配類型的單孢子基因組進行了測序和De novo組裝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個單孢子基因組大小分別為48.98、51.07 Mb，2個基因組中GC含量的百分比趨于一致（約47.3%），見表1。Liu等[40]同時以粗柄羊肚菌的單孢子為研究對象進行基因組測序研究。基于全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，黑色羊肚菌（皺柄羊肚菌、梯棱羊肚菌）與黃色羊肚菌（粗柄羊肚菌）的基因家族均發(fā)生了不同程度的擴張和收縮[40]，擴張的基因與DNA代謝有關(guān)。

此外，Han等[48]首次對六妹羊肚菌進行基因組測序分析，比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，六妹羊肚菌具有較多的特有基因數(shù)，其中個別特異表達的基因與膀胱癌、甲狀腺癌和急性髓系白血病有關(guān)，這些結(jié)果為生物學(xué)功能的進一步挖掘提供了寶貴的基因組資源。Wingfield等[49]利用從中國四川省涼山彝族自治州的森林土壤中分離得到的七妹羊肚菌菌株MG91提取DNA，并進行基因組測序分析，功能注釋中發(fā)現(xiàn)大量的CAZYme酶基因存在較高水平的表達。一般認為，CAZYme酶在降解過程中起著重要作用，大多數(shù)胞壁降解酶被認為具有分解植物多糖如纖維素、半纖維素和果膠的能力，推測羊肚菌具有對腐爛植物碎片的降解潛力。

表1 羊肚菌屬的全基因組進化Table 1 Genome-wide evolution of Morchella

然而目前，對于羊肚菌屬物種的全基因組測序主要是羊肚菌分離菌株（單孢子）、子實體及菌絲的研究，而且分析大多從基因組的結(jié)構(gòu)特征入手，包含蛋白質(zhì)預(yù)測和功能注釋及基因組比較分析等方面。這些研究成果加深了對羊肚菌基因組基本特征的了解，今后的研究應(yīng)從基因組中的功能基因著手，深入研究基因的功能及其表達調(diào)控模式，為進一步理解羊肚菌的基因及其生物學(xué)功能鑒定基礎(chǔ)，同時也為羊肚菌屬類群的設(shè)計分子育種提供科學(xué)依據(jù)。

5 結(jié)語與展望

本文對羊肚菌屬的群體遺傳學(xué)和基因組進化的研究進展進行了深入綜述。群體遺傳學(xué)研究揭示羊肚菌屬具有較高水平的遺傳多樣性，不同地理區(qū)域的羊肚菌類群具有差異化的變異模式，表現(xiàn)出群體間遺傳變異高于群體內(nèi)的特性。基因組測序分析發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬類群存在大量的ncORFs、較多的內(nèi)含子和高度的內(nèi)部重復(fù)序列。然而，關(guān)于羊肚菌屬群體基因組進化方面的研究，一些問題仍然沒有解決。（1）需要采集覆蓋羊肚菌整個自然地理分布范圍的群體樣本，對其進行群體遺傳多樣性和進化特征的研究；（2）需要采用多個不同遺傳背景的分子標記，如單親遺傳的線粒體DNA標記和雙親遺傳的核基因分子標記，對羊肚菌屬資源進行準確的遺傳變異檢測；（3）要對羊肚菌屬物種線粒體與細胞核之間的遺傳物質(zhì)交換、協(xié)調(diào)作用的遺傳機制等問題開展研究；（4）要利用大規(guī)模全基因組測序技術(shù)進一步挖掘不同環(huán)境下羊肚菌自然群體對環(huán)境的適應(yīng)性進化機制。進一步通過野生羊肚菌和栽培羊肚菌類群間的基因組比較分析，找到人工馴化的、具有重要經(jīng)濟價值性狀的關(guān)鍵基因?qū)ζ溥M行功能研究，以期為羊肚菌屬資源的科學(xué)保護和新品種培育提供科學(xué)參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突