楊欣英，傅曉娜，金 洪，張 珅

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100045

Duchenne/Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD/BMD)是一類(lèi)因編碼DMD基因突變所致的X染色體連鎖隱性遺傳病。DMD發(fā)病率接近0.04%，多見(jiàn)于男性，一般發(fā)病于3～5歲，6歲即可出現(xiàn)行走障礙，主要死因?yàn)樾牧λソ呋蚝粑ソ?。BMD整體癥狀較輕，正常行走能力可保持至16歲以上[1]。DMD基因位于Xp21.2，包括79個(gè)外顯子和8個(gè)啟動(dòng)子，橫跨2 200 kb長(zhǎng)度DNA區(qū)域，存在極高的突變風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。目前，BMD/DMD診斷主要依靠基因檢測(cè)，而對(duì)于BMD和DMD鑒別診斷無(wú)法單純通過(guò)基因檢測(cè)完成。20世紀(jì)80年代末，國(guó)外學(xué)者提出閱讀框架原則，即移碼突變可形成截短且無(wú)功能抗肌萎縮蛋白，可診斷為DMD；而基因缺失因外顯子閱讀框未改變，臨床癥狀輕微，可診斷為BMD[4]。目前，臨床醫(yī)師可通過(guò)包括Humgen、Edystrophin在內(nèi)的網(wǎng)站檢測(cè)DMD基因異常與周?chē)怙@子閱讀框及臨床表型間的關(guān)系[5]?？紤]到BMD和DMD患兒預(yù)后的明顯差異，臨床亟需通過(guò)準(zhǔn)確的分子生物學(xué)診斷及臨床分型最大限度地實(shí)現(xiàn)基因精準(zhǔn)治療。本研究采用IDT捕獲芯片+NGS技術(shù)完成基因篩查，旨在探討B(tài)MD/DMD患兒臨床及基因檢測(cè)特征。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2020年5月至2021年5月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院收治的54例BMD/DMD患兒為研究對(duì)象。根據(jù)BMD/DMD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將DMD患兒納入DMD組(n=42)，將BMD患兒納入BMD組(n=12)。DMD組中，患兒均為男性；就診年齡3個(gè)月至13歲，平均年齡(4.21±1.87)歲；無(wú)血緣關(guān)系，父母非近親結(jié)婚。BMD組中，患兒均為男性；就診年齡4個(gè)月至14歲，平均年齡(4.07±1.79)歲。本研究設(shè)計(jì)符合《赫爾辛基宣言》要求。患兒家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法 采集患兒外周靜脈血3 ml，通過(guò)多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)完成DMD基因共79個(gè)外顯子篩查，發(fā)現(xiàn)缺失和/或重復(fù)突變。采用NGS技術(shù)，通過(guò)MI.PA檢測(cè)基因未見(jiàn)異常的患兒。進(jìn)一步采用IDT捕獲芯片+NGS技術(shù)檢測(cè)單核苷酸水平突變，經(jīng)Sanger法驗(yàn)證。閱讀框架原則：BMD基因突變符合整碼突變，DMD基因突變符合移碼突變[6]。

1.3 家系基因檢測(cè) 收集同意接受基因驗(yàn)證患兒母親的外周靜脈血3 ml。其中，患兒為缺失/重復(fù)水平突變采用多重連接探針擴(kuò)增驗(yàn)證；患兒為單核苷酸水平突變采用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 患兒臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)分析結(jié)果 12例BMD患兒因肌酸激酶水平異常升高或肌肉酸痛就診。DMD患兒中，16例年齡<4歲患兒因肌酸激酶水平異常升高、行走不穩(wěn)或易摔倒就診；26例年齡≥4歲患兒因乏力、不愿行走及上樓需扶梯就診。54例患兒肌酸激酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平均異常升高，平均肌酸激酶水平(13 720±6 450)IU/L，平均谷丙轉(zhuǎn)氨酶(278.56±94.20)IU/L，平均天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(205.90±71.63)IU/L。BMD組患兒平均肌酸激酶水平為(2 815±970)IU/L，低于DMD組的(15 940±5 210)IU/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 基因檢測(cè)資料分析 54例患兒中，采用多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)DMD基因異常共43例，其中，大片段缺失和重復(fù)突變分別為36例、7例。采用多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)基因無(wú)異?；純涸傩蠳GS檢測(cè)11例，檢出微小突變7例；4例存在包含兩個(gè)區(qū)域基因缺失或重復(fù)，可見(jiàn)典型DMD臨床表現(xiàn)。

2.3 閱讀框架原則符合率分析 43例基因缺失/重復(fù)患兒中，閱讀框架原則符合率為88.37%(38/43)。29例移碼突變的DMD患兒中，閱讀框架原則符合率為96.55%(28/29)。14例整碼突變的BMD患兒中，閱讀框架原則符合率為71.43%(10/14)。

2.4 家系基因檢測(cè)分析 20例患兒母親完成驗(yàn)證基因檢測(cè)，DMD基因陽(yáng)性率為70.00%(14/20)。

3 討論

本研究納入BMD/DMD患兒共54例，42例DMD患兒臨床癥狀較為嚴(yán)重，年齡≤4歲患兒主要表現(xiàn)為肌酸激酶水平異常升高或行走不穩(wěn)，而學(xué)齡前或?qū)W齡兒童則可出現(xiàn)乏力、肌無(wú)力及行走困難；BMD患兒臨床癥狀相對(duì)較輕，主要表現(xiàn)為肌酸激酶水平升高或肌肉酸痛。本研究中，患兒均可見(jiàn)肌酸激酶水平升高，且BMD患兒平均肌酸激酶水平低于DMD患兒(P<0.05)，提示肌酸激酶水平升高水平可在一定程度上用于BMD/DMD的鑒別診斷。此外，對(duì)于臨床上原因不明的血清酶學(xué)指標(biāo)(天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等)升高需關(guān)注，可能存在罹患BMD或DMD的風(fēng)險(xiǎn)[6]。

有研究報(bào)道，多重連接探針擴(kuò)增聯(lián)合NGS測(cè)序基因突變檢出率>90%，具有高靈敏度，且相比肌肉活檢更經(jīng)濟(jì)、方便[7]。本研究采用多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)DMD基因異常共43例，其中，大片段缺失和重復(fù)突變分別為36例、7例；采用多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)基因無(wú)異常的11例患兒再行NGS檢測(cè)，檢出微小突變7例，整體檢出率與既往研究[8]報(bào)道一致，同時(shí)，多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果中缺失和重復(fù)突變占比(69%比13%)也與既往研究[9]結(jié)果相近。此外，4例患兒存在包含兩個(gè)區(qū)域基因缺失或重復(fù)，可見(jiàn)典型的DMD臨床表現(xiàn)，而這一復(fù)雜基因重排理論上較為少見(jiàn)，國(guó)外研究報(bào)道中發(fā)生率僅為0.07%～1.32%[10]，但本研究占比達(dá)8%，是否與人種及檢測(cè)手段差異有關(guān)仍有待探索。11例采用多重連接探針擴(kuò)增檢測(cè)基因無(wú)異常患兒再行NGS檢測(cè)，檢出微小突變7例?；驕y(cè)序技術(shù)無(wú)法檢測(cè)到內(nèi)含子、啟動(dòng)子及調(diào)控區(qū)域序列致病性突變，若臨床高度懷疑但未見(jiàn)到外顯子基因異常，患者仍需肌肉活檢確診[11]。

本研究中，閱讀框架原則符合率為88.37%(38/43)，與基因遺傳病數(shù)據(jù)庫(kù)[12]結(jié)果相近。本研究移碼突變DMD患兒閱讀框架原則符合率為96.55%(28/29)，整碼突變BMD患兒的閱讀框架原則符合率為71.43%(10/14)，其中，整碼突變患兒的閱讀框架原則符合率低于既往研究[13]結(jié)果，筆者認(rèn)為這主要與納入樣本量較少有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，部分患兒基因型與臨床表型不一致，且無(wú)法通過(guò)閱讀框架原則進(jìn)行解釋?zhuān)渲校?例患兒45～47號(hào)外顯子缺失為整碼突變，臨床診斷DMD和BMD分別為1例、2例；4例患兒45～47號(hào)外顯子缺失為整碼突變，臨床診斷DMD和BMD分別為2例、2例。進(jìn)一步查閱相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，45～47號(hào)和45～48號(hào)外顯子缺失絕大多數(shù)表現(xiàn)為BMD，僅少量診斷為DMD[14]。DMD/BMD患兒基因型與臨床診斷閱讀框架原則不符可能與以下因素有關(guān)：(1)內(nèi)含子中部分序列異常，潛在的剪接增強(qiáng)子激活，盡管未影響蛋白分離，但干擾后續(xù)mRNA剪接方式，從而造成臨床表型與基因型不一致；(2)RNA降解控制效率間個(gè)體差異造成臨床癥狀嚴(yán)重程度不同，進(jìn)而導(dǎo)致臨床表型間差異形成；(3)內(nèi)含子斷裂造成假外顯子形成，誘導(dǎo)基因重排出現(xiàn)，假外顯子被識(shí)別后，讀碼閱讀框架原則失效，無(wú)功能抗肌萎縮蛋白表達(dá)；(4)可變剪接時(shí)外顯子出現(xiàn)跳躍，抗肌萎縮蛋白合成后羧基末端保留，使其仍可形成效應(yīng)功能，最終導(dǎo)致臨床表型與基因型不一致[15-17]。

本研究中，20例驗(yàn)證患兒母親完成基因檢測(cè)，DMD基因陽(yáng)性率為70.00%(14/20)。筆者認(rèn)為，對(duì)于存在明確家族史的患兒，可加強(qiáng)遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷，避免BMD/DMD患兒出生。約30%的BMD/DMD患兒屬于散發(fā)病例，但需要注意的是，盡管這部分患兒母親未檢出基因突變，但無(wú)法排除攜帶致病基因異常的可能，異?？赡馨l(fā)生在胚胎早期體細(xì)胞嵌合時(shí)或生殖嵌合卵細(xì)胞減數(shù)分裂階段。此外，隱匿傳遞致病基因暴露繼發(fā)突變也可能存在[18-19]。因此，合理、科學(xué)的產(chǎn)前診斷對(duì)于降低DMD/BMD發(fā)病率、減輕家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。

綜上所述，BMD/DMD患兒具有各自獨(dú)特臨床及基因檢測(cè)特征，閱讀框架原則可能更適用于DMD預(yù)測(cè)。