陳鵬業(yè)，孫建偉，劉躍貞，陸麗峰

骨肉瘤(OS)是一種侵襲性骨腫瘤，其特征主要是惡性類骨質(zhì)生成和成骨細(xì)胞分化。治療方式以手術(shù)切除為主，但多數(shù)OS患者的預(yù)后不良。隨著順鉑、多柔比星、異環(huán)磷酰胺以及甲氨蝶呤在OS的新輔助化療中的應(yīng)用，患者的5年生存率已增加至50%～80%[1]。但是，OS發(fā)病機(jī)制和病因仍未明確闡明。MicroRNA(miRNA或miR)是一種長(zhǎng)度為22～24個(gè)核苷酸的短鏈保守非編碼RNA，被認(rèn)為是一種應(yīng)用前途極廣的惡性腫瘤診斷和預(yù)后工具。miRNA通過(guò)與互補(bǔ)靶mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或阻止mRNA被翻譯。故miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。miRNA的過(guò)表達(dá)通常導(dǎo)致靶基因的死亡表達(dá)。有證據(jù)顯示98種miRNA位于脆弱位點(diǎn)和癌癥基因組區(qū)域，表明miRNA與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)[2]。通過(guò)介導(dǎo)癌基因或腫瘤抑制因子的表達(dá)，miRNA在腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。

miR-133b是miR-133家族的成員，被稱為肌肉特異性miRNA，介導(dǎo)成肌細(xì)胞增殖和分化。最近，miR-133b也在肌源性肉瘤中被發(fā)現(xiàn)。此外，miR-133b在胃癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、前列腺癌和肺癌中的表達(dá)降低，表明miR-133b在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展中起重要作用[3-5]。然而，miR-133b在骨肉瘤中的表達(dá)和功能尚不清楚。本研究采用MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)及Taswell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-133b在骨肉瘤細(xì)胞中的生物學(xué)行為，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤qRT-PCR檢測(cè)人骨肉瘤細(xì)胞系(MG-63)細(xì)胞與人正常成骨細(xì)胞系(hFOB)購(gòu)置于美國(guó)ATCC公司，Lipofectamine 2000、miR-133b mimics、scramble、MTT粉、Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 qRT-PCR檢測(cè)miR-133b的表達(dá) 采用RNA抽提試劑盒抽提MG-63與hFOB細(xì)胞中的總RNA，借助于逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)設(shè)備，進(jìn)行cDNA的合成，并將其存儲(chǔ)在-70 ℃環(huán)境中，考慮到實(shí)際的研究需求以及臨床表征，對(duì)PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行必要的優(yōu)化調(diào)整，通過(guò)必要的設(shè)備、試劑增加，提升擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)際效果。同時(shí)出于整個(gè)研究的需要，對(duì)循環(huán)的溫度、時(shí)間及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行嚴(yán)格控制，通過(guò)這種方式，提升檢測(cè)結(jié)果表達(dá)的有效性。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn) 按照相關(guān)臨床指標(biāo)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的培育，在培育環(huán)節(jié)，需要將質(zhì)粒依據(jù)轉(zhuǎn)染的要求，進(jìn)行系列化的操作，以保證實(shí)驗(yàn)的有效性，并在此基礎(chǔ)上，逐步形成miR-133b mimics與scramble 2個(gè)組別。培育環(huán)節(jié)，分別將轉(zhuǎn)染處理后獲取的細(xì)胞接種到孔板中，培育周期保持在4 h，4 h后將孔板取出，加入適量的DMSO 150 μl，并進(jìn)行低速振動(dòng)，將振動(dòng)過(guò)程中出現(xiàn)的波長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)、準(zhǔn)確的記錄和分析。為排除干擾因素的影響，連續(xù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)與分組同劃痕實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，待長(zhǎng)至臨近飽和，用PBS緩沖液將板中細(xì)胞洗滌2遍，用無(wú)菌10 μl Eppendorf Tip在細(xì)胞板上劃痕。倒置顯微鏡下分別觀察各組細(xì)胞0 h與48 h的劃痕距離，并攝像。軟件測(cè)量各孔細(xì)胞任意3個(gè)部位的不同劃痕距離，計(jì)算各組傷口愈合率，取3組實(shí)驗(yàn)的平均值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)節(jié)，采取分組劃痕實(shí)驗(yàn)的機(jī)制，通過(guò)在侵襲實(shí)驗(yàn)中增加一定濃度比重的基質(zhì)膠，獲取基質(zhì)膜。在完成上述操作后，研究人員采取分層處理的方式，將100 μl稀釋液放置于上層，在下層則加入適量的培養(yǎng)液，并將整個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度控制在37 ℃環(huán)境內(nèi)，靜置36 h，靜置完成后，研究人員提取上層未遷移的細(xì)胞，進(jìn)而必要的實(shí)驗(yàn)處理。使用光學(xué)顯微鏡等設(shè)備，進(jìn)行觀察和記錄。

2 結(jié) 果

2.1 MG-63細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)水平檢測(cè) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MG-63細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)水平為(0.418±0.032)，低于hFOB的表達(dá)水平(3.275±0.148)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=184.868，P<0.01)。

2.2 外源高表達(dá)miR-133b對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)系統(tǒng)培育，其miR-133b mimics組別中，OD值數(shù)0.426～0.448，與scramble組別相比，數(shù)據(jù)差異較為明顯，具有研究?jī)r(jià)值與意義(t=110.616，P<0.01)。表達(dá)miR-133b能抑制癌細(xì)胞的增殖。

2.3 外源高表達(dá)miR-133b對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-133b mimics組48 h后傷口愈合率分別為(51.7±6.4)%，與scramble組(72.3±9.5)%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.621，P<0.01)。提示在人骨肉瘤MG-63細(xì)胞高表達(dá)miR-133b能抑制癌細(xì)胞的遷移。

2.4 外源高表達(dá)miR-133b對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞侵襲的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-133b mimics組穿過(guò)基質(zhì)膠的人骨肉瘤MG-63細(xì)胞數(shù)量為(149±11)與scramble組(216±18)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.119，P<0.01)。提示在人骨肉瘤MG-63細(xì)胞高表達(dá)miR-133b能抑制癌細(xì)胞的侵襲。

3 討 論

自20世紀(jì)70年代采用術(shù)前和術(shù)后化療以來(lái)，部分OS患者的5年無(wú)生存率(EFS)已達(dá)到70%。然而，轉(zhuǎn)移性O(shè)S患者的預(yù)后較差，5年EFS仍≤20%。據(jù)報(bào)道，miRNA有助于OS的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并可能為治療該疾病提供新的治療靶點(diǎn)。

研究已證實(shí)，微小RNA可以作為致癌基因或腫瘤抑制基因來(lái)介導(dǎo)惡性腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)育和進(jìn)展。迄今為止，研究者已鑒定出OS中miRNA的表達(dá)譜。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常人成骨細(xì)胞相比，在骨肉瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了26種差異表達(dá)的miRNA[6]。Maire等發(fā)現(xiàn)與正常人成骨細(xì)胞相比，從7個(gè)人骨肉瘤組織樣本中鑒定出38個(gè)差異表達(dá)的miRNA[7]。Novello等發(fā)現(xiàn)包括miR-1，miR-133b和miR-378在內(nèi)的12種miRNA在高級(jí)和低級(jí)OS中差異表達(dá)[8]。然而，這些研究很少共享差異表達(dá)的常見(jiàn)miRNA。此外，即使在同一項(xiàng)研究中，OS組織中的幾種差異表達(dá)的miRNA也不能在骨肉瘤細(xì)胞系中持續(xù)表達(dá)。這表明在細(xì)胞系、組織或患者的來(lái)源之間的差異可能會(huì)影響骨肉瘤的miRNA表達(dá)譜。

有證據(jù)表明miR-133b在肌肉組織中特異性表達(dá)，在肌肉發(fā)育、心肌分化和心肌肥厚中起重要作用，通常被認(rèn)為是肌肉特異性miRNA。最近的報(bào)道表明，miR-133b在其他生物學(xué)過(guò)程如神經(jīng)元和脂肪分化中也起著至關(guān)重要的作用。此外，據(jù)報(bào)道稱miR-133b在多種惡性腫瘤中對(duì)于細(xì)胞的自身的增殖、衰亡等生命周期有著最為直接的影響。相關(guān)研究充分表明，胃癌、直腸癌患者在發(fā)病后，其細(xì)胞內(nèi)miR-133b指數(shù)明顯下降[9]。出現(xiàn)這種情況的主要原因在于：miR-133b使得人體內(nèi)細(xì)胞的外源表現(xiàn)較為特異，實(shí)現(xiàn)癌癥細(xì)胞增殖、遷移的有效抑制，從而避免癌癥轉(zhuǎn)移，達(dá)到防范化解癌癥風(fēng)險(xiǎn)的目的[10-11]。

為了評(píng)估m(xù)iR-133b在骨肉瘤中的表達(dá)與生物學(xué)功能，研究首先通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PDL1在人乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，接下來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-133b mimics來(lái)外源高表達(dá)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)[12-14]。從MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，人骨肉瘤MG-63細(xì)胞在進(jìn)行miR-133b的表達(dá)后，細(xì)胞自身的繁殖能力明顯降低，依托劃痕實(shí)驗(yàn)，在很大程度上，論證了這種內(nèi)在聯(lián)系。同時(shí)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)也表明miR-133b在表達(dá)后，癌細(xì)胞的活性受到有效控制，癌癥得到有效應(yīng)對(duì)。

綜上所述，miR-133b在OS中表達(dá)下調(diào)，外源高表達(dá)miR-133b能抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖與遷移侵襲，表明miR-133b可作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)用于OS的治療。