劉新艷,趙浩安,楊二林,程 妮,曹 煒,3

(1.西北大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 西安 710069;2.西北大學(xué) 化工學(xué)院,陜西 西安 710069;3.陜西省蜂產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心,陜西 西安 710065)

高脂血癥是引起各種心血管疾病和代謝紊亂的主要因素[1],極大地威脅著人類的生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,近15年來,以高脂血癥為主的心腦血管疾病是造成人類死亡的頭號殺手，2016年全球約有1 520萬人死于心腦血管疾病,且預(yù)測心血管疾病將繼續(xù)成為人類死亡的主要原因[2]。高脂血癥是由飲食引起的機體膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白水平超出正常范圍，而造成的一種全身性脂質(zhì)代謝異常疾病[3],目前最理想的治療高脂血癥藥物價格較為昂貴,且具有一定的副作用[4],因此開發(fā)安全且具有降血脂的功能性食品具有重要的意義。已有研究表明,食物中的多酚[5]、多糖[6]、皂苷[7]等均對預(yù)防和治療高脂血癥具有一定作用。

絞股藍作為一種可用于保健食品的天然產(chǎn)物[8],已被證明具有降血脂的作用。絞股藍系葫蘆科絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物,廣泛分布于我國秦嶺及長江以南地區(qū)[9]?！毒然谋静荨分杏涊d民間多食用絞股藍以治療咳嗽、痰喘、慢性氣管炎、傳染性肝炎等疾病[10]。現(xiàn)代藥理及食品科學(xué)理論已證明其具有降血脂[11]、降血糖[12]、神經(jīng)保護[13]、減肥[14]等諸多功效。研究表明這些功效主要來自于絞股藍中的皂甙[15]、多酚[16]和多糖[17]等生物活性成分。尤其是其具有和人參皂苷相同的四環(huán)三萜達瑪烷型結(jié)構(gòu),因此絞股藍皂甙一直是絞股藍的研究熱點和評價標(biāo)準(zhǔn),其中皂苷XLIX和A是目前已知能夠定量的絞股藍皂苷。近年來,有企業(yè)將絞股藍加工為茶便于飲用,但絞股藍茶味道苦澀,其中的甜味物質(zhì)較少,游離糖主要以多糖形式存在[18]。因而絞股藍相關(guān)產(chǎn)品還是以中草藥和農(nóng)產(chǎn)品為主,產(chǎn)品形式十分單一,因此，多元化、無苦味的絞股藍產(chǎn)品開發(fā)顯得尤為迫切。

蜂蜜作為一種具有藥用價值與營養(yǎng)價值的天然食品,不僅在食品配方中充當(dāng)甜味劑和添加劑,也是降血脂類保健食品的主要原料之一[19]。已有研究表明蜂蜜對血脂異常大鼠具有保護作用[20],將其制備成絞股藍蜜膏不僅可以起到降脂作用，還可以改善絞股藍的苦澀味道。因此本研究將絞股藍水提物與蜂蜜混合制備絞股藍蜜膏,探究絞股藍蜜膏對高脂高糖飲食誘導(dǎo)的高脂血癥小鼠的影響機制,為豐富蜂蜜和絞股藍產(chǎn)品形式提供參考,也為功能性食品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍全草采自陜西省平利縣,中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品平利絞股藍。蜂蜜通過陜西省蜂產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心合作蜂農(nóng)于2018年收集,經(jīng)花粉含量分析鑒定為洋槐蜜。洋槐蜜的基本理化指標(biāo)根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)測得[21]，其中水分(18.3%)、葡萄糖(31.5%)、果糖(39.9%)、蔗糖(1.08%)，電導(dǎo)率為0.22 mS/cm、淀粉酶值為27.1 mL/(g·h)，pH4.0)。人參皂苷XLIX 和人參皂苷A對照品(HPLC級,純度>98%)購于四川省維克奇股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TECAN Infinite 200 PRO 多功能讀板機，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司;TL16G 高速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;FD1C50冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;722G紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 絞股藍蜜膏的制備

取絞股藍藥材烘干,粉碎,過60目標(biāo)準(zhǔn)篩。精密稱定1 g絞股藍粉末,置于圓底燒瓶中,加入50 mL 75%的乙醇在80℃下回流提取2次,每次1 h。冷卻后離心并合并提取液,將提取液采用冷凍干燥得絞股藍水提物,與蜂蜜以1∶9配制所得。絞股藍水提物和絞股藍蜜膏如圖1A所示。

總皂苷含量的測定采用香草醛高氯酸比色法[22],單體皂苷的測定采用高效液相色譜法[23]。測得該絞股藍水提物中總皂苷含量為30.00 mg/g,單體皂苷XLIX 含量為0.65 mg/g,單體皂苷A含量為0.11 mg/g,色譜圖如圖1B所示。

圖1 絞股藍蜜膏Fig.1 The paste of Gynostemma and honey(PGH)

1.4 動物實驗設(shè)計

雄性C57BL/6型小鼠30只,體質(zhì)量為16～18 g,購于西安交通大學(xué)動物實驗中心,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(陜) 2017-001。小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機分為3組,每組10只,即正常組、高脂組和絞股藍蜜膏組。正常組全實驗周期給予標(biāo)準(zhǔn)飲食,高脂組和絞股藍蜜膏組給予高脂飲食誘導(dǎo)小鼠高脂血癥。若高脂組小鼠血清TC濃度不低于5.20 mmol/L,TG濃度不低于1.70 mmol/L,且顯著高于正常組小鼠,表明高脂血癥小鼠造模成功[24]。8周后,給予絞股藍蜜膏組小鼠灌胃絞股藍蜜膏10 g/kg小鼠體重 (以總皂苷含量計30 mg/kg),正常組和高脂組小鼠灌胃同等劑量生理鹽水,每天一次。第16周結(jié)束末次灌胃后,小鼠禁食不禁水12 h并稱重,眼眶取血,頸椎脫臼處死小鼠,解剖取出肝臟、腎臟、附睪脂肪等組織待后續(xù)分析。

動物飼料由福貝世亨生物醫(yī)藥(上海)有限公司提供。標(biāo)準(zhǔn)飲食組成為9%水、18%～22%蛋白質(zhì)、4%脂肪、5%纖維、8%灰分和52%～56%無氮浸出物,高脂飼料組成為49.5%標(biāo)準(zhǔn)飲食、20.4%豬油、15%蔗糖、12.3%蛋白質(zhì)、2%預(yù)混料和0.8%麥芽糊精。

1.5 生化指標(biāo)測定

血清生化指標(biāo)，小鼠眼眶取血收集于1.5 mL離心管中,3 500 r/min低溫離心10 min分離血清測定膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的水平。按試劑盒說明進行操作。

肝臟生化指標(biāo)，取0.2 g肝臟組織于離心管中,按照1∶9(W∶V)加入生理鹽水,在冰水浴條件下機械勻漿,將制備好的肝勻漿2 000 r/min低溫離心15 min取上清液于離心管中,測定肝臟組織中的TC、TG、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。

生化指標(biāo)具體操作按照試劑盒說明進行。TC，TG，LDL，AST，ALT，GSH-Px，SOD，MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA法測定IL-6，TNF-α，adipokine，leptin的水平[25]。所有試劑和樣品在室溫下平衡30 min,分別將樣品(50 μL)和抗體(50 μL)加入ELISA孔中,于37℃下孵育30 min。然后丟棄反應(yīng)溶液,用洗滌液沖洗5次。隨后添加顯色劑,于37℃下避光15 min進行顯色反應(yīng)。添加終止溶液使反應(yīng)終止后使用多功能讀板器測定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品IL-6，TNF-α，adipokine，leptin水平。

1.7 實時熒光定量PCR測定肝臟組織中炎癥因子基因表達

總RNA的提取采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA提取試劑盒[26],按試劑盒說明操作。取RNA樣本,采用PrimeScriptrt RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA樣本,根據(jù)基因序列特異性設(shè)計引物,通過實時熒光定量PCR,采用SYBR GREEN染料法,以β-actin為內(nèi)參基因作定量檢測,并用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行分析。

1.8 組織病理學(xué)檢查

將小鼠肝臟及附睪脂肪用10%中性甲醛溶液固定,經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、組織切片、脫水脫蠟步驟后,經(jīng)蘇木精伊紅(H&E)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟及脂肪組織。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件作圖,SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,組間比較采用方差分析和t檢驗,結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05有顯著差異,P<0.01有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍蜜膏改善小鼠高脂血癥癥狀

本實驗首先測定了小鼠的體重、肝臟指數(shù)和空腹血糖(見圖2A，2B和2C)。在實驗期間,老鼠每兩周被稱一次體重。在第8周結(jié)束時,高脂組小鼠體重達33.94 g,比正常組小鼠增加了31.50%。經(jīng)過8周絞股藍蜜膏灌胃后,體重下降了18.23%,比HFD組高19.37%。此外,高脂組小鼠的肝臟指數(shù)和空腹血糖也明顯高于正常組,與LFD組相比有顯著性差異(P<0.05)。絞股藍蜜膏的攝入完全抑制了肝臟指數(shù)和空腹血糖的增加。

由圖2D，2E和2F可知,正常組小鼠的各項血液和肝臟指標(biāo)均處于正常水平。與正常組相比,高脂組的ALT，AST，TC，TG，LDL濃度均顯著升高(P<0.05),表明高脂飲食會造成小鼠高脂血癥。與高脂組相比,絞股藍蜜膏組小鼠的血液和肝臟指標(biāo)均得到改善,ALT，AST，LDL水平均顯著下降(P<0.05),其中ALT，AST，TG，LDL均達到正常水平。而由于個體差異,絞股藍蜜膏組與高脂組小鼠的HDL水平未分析出顯著性差異,因此未在圖中顯示該數(shù)據(jù)。總體來看,絞股藍蜜膏改善了小鼠高脂血癥的血液和肝臟指標(biāo)。

A 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠體重；B 肝臟指數(shù)；C 血清TC、TG和LDL；D 血清ALT和AST；E 空腹血糖；F 肝臟組織TC和TG注：a,b,c表示差異顯著(P<0.05)圖2 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠基本生化指標(biāo)的影響Fig.2 The effect of PGH on biochemical parameters of hyperlipidemic mice

2.2 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠組織病理學(xué)的影響

通過小鼠肝臟組織HE染色可以看出(見圖3A),正常組小鼠肝細胞以中央靜脈為中心,排列比較整齊,肝細胞清晰。細胞核位于細胞中央同時核大而圓,未見脂肪空泡,表明基礎(chǔ)飼料對小鼠生長無不良影響。與正常組相比,高脂組小鼠肝細胞排列混亂,細胞核位置雜亂不一,同時肝細胞腫大細胞核被擠到周邊,有大量的脂質(zhì)沉積,肝細胞內(nèi)充滿了大小不等的脂肪滴,形成大量的脂肪空泡。與高脂組比較,絞股藍蜜膏組小鼠的肝臟病變程度有一定的減輕,肝細胞排列較整齊,基本未出現(xiàn)脂肪空泡。

通過小鼠脂肪組織HE染色可以看出(見圖3B),正常組小鼠的脂肪組織細胞大小均勻一致、排列緊密有序、各個細胞輪廓圖清晰、脂肪組織細胞較小。與正常組比較,高脂組小鼠脂肪細胞均出現(xiàn)不同程度的增大,且大小不一。與高脂組比較,絞股藍蜜膏組小鼠的脂肪組織細胞有一定程度的減小,且相對緊密,表明絞股藍蜜膏對脂肪組織變性有一定的抑制作用。

組織病理學(xué)結(jié)果與上述生化分析結(jié)果一致。表明絞股藍蜜膏對肝組織和脂肪組織有一定的保護作用,能夠改善高脂高糖引起的高脂血癥。

A 小鼠肝臟組織HE染色;B 小鼠脂肪組織HE染色圖3 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠組織病理學(xué)的影響Fig.3 The effect of PGH on pathologic features of hyperlipidemic mice

2.3 絞股藍蜂蜜對高脂血癥小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

已有研究表明,氧化應(yīng)激發(fā)生在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和高脂血癥小鼠中[27]。我們首先測定了氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的含量,以評價高脂血癥小鼠的氧化損傷。由圖4可知,與正常組相比,高脂組小鼠肝臟MDA含量增加60.4%,SOD和GSH-Px活性分別下降22.9%和32.5%。絞股藍蜜膏的攝入對氧化應(yīng)激抵抗有明顯的改善作用,丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)改善率分別為65.2%，97.2%，61.0%。其中MDA含量顯著下降(P<0.05),GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)且與正常組小鼠基本相當(dāng)。

飼喂高脂飼料導(dǎo)致的肥胖及高脂血癥往往伴隨著活性氧失調(diào)引起的氧化應(yīng)激[28]。當(dāng)氧化應(yīng)激持續(xù)很長一段時間時,NO等活性氧增多,攻擊細胞膜所形成的過氧化物增多,從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高,SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性降低[29]。而食源性皂苷[30]和酚酸[31]的攝入可以提高機體氧化應(yīng)激防御,本實驗表明絞股藍蜜膏攝入使得高脂小鼠機體的氧化損傷程度減弱,機體抗氧化能力提高。

A 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠SOD;B GSH-Px;C MDA注：a,b,c表示差異顯著(P<0.05)圖4 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.4 The effect of PGH on oxidative stress indexes of hyperlipidemic mice

2.4 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠相關(guān)蛋白的影響

高脂飲食導(dǎo)致活性氧的積聚和炎癥因子的釋放[32]。在測定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)后,我們對高脂血癥小鼠蛋白表達水平進行評估。由圖5可知,與正常組相比,高脂組的IL-6，TNF-α，leptin水平顯著上升(P<0.05);絞股藍蜜膏攝入后,顯著降低了IL-6，TNF-α，leptin水平(P<0.05)。為進一步評價絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠的影響機制,我們在基因水平上對其進行評估。

A IL-6；B TNF-α；C 脂肪因子；D 瘦素注：a,b,c表示差異顯著(P<0.05)圖5 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠相關(guān)蛋白的影響Fig.5 The effect of PGH on inflammatory factors of hyperlipidemic mice

2.5 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠炎癥相關(guān)mRNA的影響

當(dāng)高脂血癥小鼠發(fā)生時,炎癥因子TNF-α，IL-1，IL-6增加,促進了降解細胞內(nèi)IκB(NF-κB的抑制劑)結(jié)合的NF-κB復(fù)合物[33-34],從而使得NF-κB從細胞核外轉(zhuǎn)移至核內(nèi),調(diào)節(jié)上述特定炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄,引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)[35]。因此,本研究測定了小鼠炎癥相關(guān)mRNA的IκB-α，IL-6，TNF-α，IFN-γ表達。由圖6可知,與高脂組相比,絞股藍蜜膏組小鼠炎癥相關(guān)mRNA的IL-6，TNF-α，IFN-γ表達明顯降低,IκB-α表達明顯升高(P<0.05)。這表明,NF-κB信號通路可能是絞股藍蜜膏治療高脂血癥小鼠的機制之一。

A IL-6；B TNF-α；C IFN-γ；D IκB-α注：a,b,c表示差異顯著(P<0.05)圖6 絞股藍蜜膏對高脂血癥小鼠炎癥相關(guān)mRNA的影響Fig.6 The effect of PGH on inflammation-related mRNA of hyperlipidemic mice

3 結(jié)論

本實驗研究了絞股藍蜜膏對高脂高糖飲食誘導(dǎo)的高脂血癥小鼠的影響機制。結(jié)果表明,絞股藍蜜膏能夠改善高脂血癥小鼠高脂血癥癥狀,降低肝臟及脂肪組織的組織病理學(xué)病變,提高氧化應(yīng)激防御,改善相關(guān)炎癥因子和mRNA的表達。因此,本研究表明了絞股藍蜜膏通過改善氧化應(yīng)激抵抗和炎癥癥狀來改善高脂高糖飲食誘導(dǎo)的高脂血癥,為絞股藍功能性食品開發(fā)提供依據(jù)。