郭騰龍，汝振遠，任尚，楊賢樹，張翔棟，申屠璐燕，張運海，曹祖兵

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036)

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，人民生活水平不斷提高，牛肉、牛奶等產(chǎn)品以其口感佳、營養(yǎng)高等優(yōu)點受到大家的青睞，人民對牛肉、牛奶的需求日益增多。以前傳統(tǒng)、落后、粗放的養(yǎng)殖模式已不能滿足行業(yè)的需求而逐漸被淘汰并轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)模化、標準化、精細化、產(chǎn)業(yè)化的養(yǎng)殖模式，通過不斷優(yōu)化飼養(yǎng)方式以及推廣應用先進養(yǎng)殖技術(shù)，提高母牛的繁殖效率[1]。

母畜繁殖效率是影響?zhàn)B殖業(yè)經(jīng)濟效益的關(guān)鍵因素。相對于豬、羊等家畜，牛的產(chǎn)犢間隔長、產(chǎn)犢少，繁殖效率低，飼養(yǎng)成本高，所以提高母牛繁殖效率對于養(yǎng)牛行業(yè)尤為重要。制約母牛繁殖效率的因素有很多，諸如產(chǎn)犢間隔、配種技術(shù)、營養(yǎng)供給、養(yǎng)殖環(huán)境、管理水平、疾病防控等，其中受產(chǎn)犢間隔的影響最大，而配種后的早期診斷能有效縮短產(chǎn)犢間隔，提高母牛繁殖效率[2]。

早期妊娠診斷是在動物配種后3個月內(nèi)，通過外部觀察行為表現(xiàn),或者測定體內(nèi)生殖相關(guān)標志物的水平來判斷母畜是否妊娠。配種后的母牛進行早期妊娠診斷，對已經(jīng)確認妊娠的母牛進行精細化管理，滿足母體自身和胎兒的營養(yǎng)需求，保證母牛能夠正常的產(chǎn)犢和哺乳；而對未妊娠的母牛，應找出原因后及時進行第2次配種，并且淘汰多次配種后仍妊娠失敗的母牛[3]。不及時或不準確的妊娠診斷都會導致母畜產(chǎn)犢間隔的延長，一頭成年母牛每錯過一個發(fā)情周期(平均21 d)，將增加70～114美元的非繁殖期飼養(yǎng)成本，而失配13.5個發(fā)情周期(大概283 d)，相當于損失一頭牛犢以及這一泌乳期的泌乳量(荷斯坦牛一個泌乳期產(chǎn)奶3 000～5 000 kg)，這也進一步說明早期妊娠診斷是影響?zhàn)B殖效益的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。因此，養(yǎng)殖人員掌握準確的早期妊娠診斷方法是至關(guān)重要的，早期妊娠診斷旨在配種后能盡早區(qū)分妊娠母牛以便進行精細化管理，同時還能在診斷過程中發(fā)現(xiàn)母牛的一些生殖疾病，進行及時治療能有效的減少妊娠母牛的流產(chǎn)風險，極大提高母牛的繁殖效率。

在妊娠初期，由于胎兒和胎盤的相互作用，母牛體內(nèi)發(fā)生一系列新陳代謝的變化，導致妊娠母牛和空懷母牛的一些生理和生化指標存在一定的差異，例如生殖器官的功能、孕酮(progesterone，P4)、早孕因子(early pregnancy factor，EPF)、妊娠相關(guān)糖蛋白(pregnancy associated glycoproteins，PAGs)、干擾素tau(IFN-τ)、體溫以及行為等方面[5-6]。人們基于這些指標的差異，開發(fā)出許多早期妊娠診斷方法，例如直腸觸診、超聲波診斷、檢測牛血中PAGs含量的早期妊娠診斷試劑盒、血小板計數(shù)法等。這些方法各有千秋，但總體都不太完善，存在診斷準確率低、操作繁瑣、成本較高等現(xiàn)實問題，難以滿足當今養(yǎng)牛行業(yè)的需求。因此，開發(fā)出一個準確、高效、低成本的早期妊娠診斷方法，對于養(yǎng)牛行業(yè)來說尤為重要。

早期妊娠診斷在養(yǎng)牛業(yè)應用最為廣泛，技術(shù)也相對比較成熟，主要分為臨床診斷和免疫學診斷，其中臨床診斷是通過檢查母體中胎兒、胎膜和羊水的存在狀態(tài)來進行診斷，主要方法有直腸觸診、超聲波檢查法等；免疫學診斷則通過檢測P4、PAGs和EPF在妊娠早期母牛的血液、尿液和乳汁中的濃度變化，來判斷母牛是否妊娠，主要檢測方法有放射免疫法(RIA)、膠體金免疫檢測技術(shù)(GICT)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等[7-8]。

1 臨床診斷

1.1 直腸檢查

黃體是卵泡細胞所形成的暫時性內(nèi)分泌器官，主要功能是分泌P4，維持妊娠。妊娠初期形成的妊娠黃體，形狀略大于周期黃體，柔軟光滑，妊娠中期和后期則較硬[9]。子宮在植入受精卵后，其子宮角會隨著胚胎的發(fā)育產(chǎn)生相應的變化，呈不對稱的發(fā)展趨勢，植入受精卵的一側(cè)子宮角要比未植入的大，并且在妊娠中后期有較為明顯的波動[10]。

牛的直腸觸診從首次提出到現(xiàn)在，已將近有兩百多年的歷史，目前仍是一些大型家畜妊娠診斷的主要方法。在人工授精50 d之后，通過觸摸母牛卵巢黃體和子宮角形狀、大小以及質(zhì)感的變化，能對母牛是否妊娠作出較為準確的判斷[11]。由于診斷過程中可能會引起母牛應激，經(jīng)直腸觸診是否會造成母牛的流產(chǎn)這個問題一直存在爭議，然而研究表明，經(jīng)直腸觸診和和胎膜滑動技術(shù)并不會增加妊娠奶牛流產(chǎn)風險，前提是在專業(yè)的獸醫(yī)以及嚴格規(guī)范的操作技術(shù)下進行[12-13]。雖然這種方法有著診斷成本低、準確率高等優(yōu)點，但僅能用于人工授精后45～60 d的妊娠診斷，很難在配種后一個情期(約21 d)進行準確診斷，且操作復雜，會因為一些生殖疾病造成誤診，例如子宮積水或者子宮蓄膿等，如果操作不慎還會造成胚胎損失，增加母牛醫(yī)源性流產(chǎn)的風險，所以需要技術(shù)員有豐富的操作經(jīng)驗[14]。

1.2 超聲波診斷法

超聲診斷法有超聲多普勒檢查法(D超)、幅度調(diào)整型超聲診斷法(A超)、實時超聲顯像法(B超)，其中 D超準確率最高，但價格極其昂貴，A超操作復雜且準確率并不理想，所以前兩者逐漸被市場淘汰，目前用的最廣泛的還是B超[15]。B超在妊娠診斷有體外探查法、陰道檢查法和直腸檢查法，對于奶牛這種體型大、被毛較多的家畜，主要采用直腸檢查法進行早期妊娠診斷[16]。通過探頭檢測回聲信號，并把這種信號以光點明暗的形式從對應的顯示器中顯示出來，回聲信號越強，光點越亮，反之則越暗[17]。羊水是一種均勻的介質(zhì)，不會反射超聲波，超聲圖像呈小圓形的液性暗區(qū)，壓迫時變形，所以利用B超進行妊娠診斷主要是觀察母牛羊水狀態(tài)，必要時再檢查卵泡和黃體，當超聲波穿過母牛子宮時，顯示器會顯示各層面的的切面圖像，根據(jù)顯示器光點明暗差異來判斷母牛是否妊娠[18]。賈國慧等[19]利用B超在奶牛妊娠26～28 d時進行妊娠診斷，準確率可達到90.48%。同時，利用B超還可以對母牛卵巢疾病進行輔助診斷，例如根據(jù)奶牛卵巢和子宮的回聲狀態(tài)來判斷卵巢囊腫、持久黃體以及排卵延遲等，有效的提高生殖疾病的診斷率。盡管B超檢查有著準確率高、操作方便等優(yōu)點，但仍受到價格昂貴的約束，診斷成本偏高，中小型的養(yǎng)牛場很難配備牛用B超儀。

2 免疫學診斷

2.1 孕酮(P4)檢測

整個妊娠期，奶牛血液和乳汁中都能檢測到較高水平的P4，妊娠初期由黃體分泌，而妊娠中后期則是由胎盤的滋養(yǎng)層細胞分泌，因此P4含量可以用來作為判斷母牛是否妊娠的重要依據(jù)[20]。劉瑞生[21]發(fā)現(xiàn)奶牛乳汁比血液中的P4含量高，并且取樣更為方便，因此常測定乳汁中的P4含量來測定奶牛是否妊娠。常用放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等方法測定奶牛乳汁孕酮(MP4)。

RIA是一種將放射性同位素的測量與免疫反應相結(jié)合的方法。在該方法中，放射標記抗原(抗體)與相應的抗體(抗原)結(jié)合，然后測定抗原-抗體結(jié)合物的放射性，并用于測定牛奶中孕酮的濃度。陳海燕等[22]用RIA法測定妊娠與非妊娠奶牛MP4含量，發(fā)現(xiàn)妊娠牛MP4含量從7～9 d開始極顯著高于未妊娠牛(P<0.01),并隨著時間增加, 差異持續(xù)增大。RIA測定奶牛MP4高效、準確和快速，但因其技術(shù)和設(shè)備要求較高，且有放射性傷害，因此一般不適合在牛場中使用。

ELISA結(jié)合了生物酶高效催化反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性，用于檢測妊娠相關(guān)激素。當用標記有生物酶的抗體在牛奶中檢測到抗原(P4)時，這種酶會與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)發(fā)生反應，導致牛奶變色，根據(jù)顏色的深淺推斷P4濃度[23]。據(jù)此，現(xiàn)已開發(fā)出高效、快速的ELISA試劑盒。吳凌等[24]自制奶牛乳汁孕酮ELISA試劑盒，通過測定配種后19～23 d奶牛MP4濃度來進行妊娠診斷，陽性和陰性準確率分別達到93.3% 和95.8%。盡管ELISA試劑盒能在奶牛一個情期內(nèi)作出較為準確的妊娠診斷，但其價格昂貴、試劑保存時間短，因而限制了該方法的廣泛應用。

2.2 早期妊娠因子(EPF)檢測

EPF又稱早期妊娠因子，是一種妊娠依賴性多分子蛋白復合物，首次發(fā)現(xiàn)于大鼠血清中[25]。EPF在胚胎發(fā)育過程中作為滋養(yǎng)層自分泌和旁分泌的免疫耐受因子，在母體中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制母體對胎兒的免疫排斥并維持妊娠[26]。此外，奶牛在受精24 h后乳汁和血清中都能檢測到EPF，一旦終止妊娠24～48 h之后，EPF將迅速消失，所以EPF在奶牛乳汁和血清中的變化可以用于早期妊娠診斷和監(jiān)測早期胚胎的狀態(tài)[27-28]。但是Cavanagh[29]認為，EPF不是胎盤特異性蛋白，腫瘤以及轉(zhuǎn)化的細胞系均可引起EPF的釋放，通過檢測EPF來進行早期妊娠診斷可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此該方法僅適用于具備特定條件的實驗室，并不適合作為養(yǎng)殖場常規(guī)檢測手段。EPF常用玫瑰花環(huán)抑制試驗和硫酸銅檢測法等進行測定。

玫瑰花環(huán)抑制試驗(rosette inhibition test，RIT)，其原理是在補體的作用下，EPF可以抑制T淋巴細胞與異種紅細胞凝集形成玫瑰花樣細胞團(玫瑰花環(huán))，玫瑰花環(huán)的抑制滴度，即R值，可以間接檢測血清EPF含量[30]。Ghaffari等[31]研究表明，當R值高于8時，可認定為懷孕，當R值低于4時則認定為未懷孕，如果R值在4～8之間，則需要重新檢測。賀加雙等[32]利用RIT法檢測不同孕期(1～9月)肉牛血樣，在配種后1個月左右，妊娠母牛和未妊娠母牛R值便出現(xiàn)差異顯著(P<0.05)，且結(jié)果與Ghaffari一致。RIT能在母牛受精后24 h后，便可通過檢測血清EPF進行妊娠診斷。但需要注意的是，該方法是根據(jù)檢測免疫抑制活性，間接反應EPF的存在，檢測結(jié)果受多種因素影響，而且該法操作繁瑣、檢測周期長，因此不適合作為一種常規(guī)的早期妊娠診斷方法。

硫酸銅法是利用硫酸根離子與EPF反應產(chǎn)生凝集的特性，對牛乳中的EPF進行定性分析，妊娠母牛乳汁中含有高濃度的EPF，能與硫酸銅反應產(chǎn)生云霧狀沉淀，故而能作為一種早期妊娠診斷的方法。李青旺等[33]用硫酸銅法對57頭黑白花母牛進行早期妊娠診斷，并通過直腸檢查進行確診，發(fā)現(xiàn)3%的硫酸銅對妊娠31～50 d的中午乳樣檢測精度最高，平均陽性率達到90.35%。該方法準確率高、操作簡便，但其只適合于哺乳期奶牛，而且需要肉眼觀察，診斷結(jié)果容易受到主觀因素影響而降低可靠性。

2.3 妊娠相關(guān)蛋白(PAGs)檢測

PAGs是胎盤滋養(yǎng)層雙核細胞與母體子宮上皮細胞融合時，合成并分泌的一類特異性糖蛋白，在反芻動物妊娠過程中起著維持妊娠和免疫調(diào)節(jié)的作用，1982年Butler等首次從妊娠母牛的胎盤膜中分離出來PAGs[34]。妊娠期間，奶牛的乳汁和血清中均可檢測到PAGs，并且PAGs濃度在受精后第25天開始逐漸升高，在第32天達到一個峰值，血清中的PAGs含量約為乳汁中的2倍[35]。然而，Commun等[36]利用ELISA法對妊娠奶牛進行妊娠診斷，結(jié)果顯示乳汁和血清中PAGs濃度檢測精度并無顯著差異。另外有研究指出，在妊娠第31天，根據(jù)母牛體內(nèi)PAGs的濃度變化，可以預測妊娠31～59 d內(nèi)胚胎的死亡率，也就是說PAGs不僅可以作為早期妊娠診斷的標志物，還可以作為預測胚胎死亡的模型[37]。

PAGs檢測法與EPF檢測法存在相同的缺陷，即只能在特定實驗室條件下進行，且PAGs檢測法的技術(shù)要求和檢測成本都要高于EPF檢測法。然而隨著研究的不斷深入，近些年來出現(xiàn)了許多商業(yè)的PAGs檢測試劑盒，在保持其高準確率的條件下不斷優(yōu)化檢測技術(shù)，更加高效的PAGs檢測技術(shù)指日可待。

2.4 IFN-τ檢測

IFN-τ是一種新型I型干擾素，不僅具有I型干擾素的共同特征，如預防病毒感染、抑制細胞增殖等，還是一種反芻動物特有的妊娠識別信號，在牛妊娠14 ～25 d時由滋養(yǎng)層細胞分泌，主要作用是通過阻礙前列腺素2α(PGF2α) 釋放來阻止黃體溶解，使P4持續(xù)分泌，并參與胚胎著床、胚胎建立等重要過程[38-39]。其作用類似于人絨毛膜促性腺激素(hCG)，因此可以用于反芻動物的早期妊娠診斷[40]。王曉艷[41]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-τ通過與特定的miRNA互作來調(diào)節(jié)妊娠早期奶牛子宮內(nèi)膜牛白細胞Ⅰ類抗原(BoLA-Ⅰ)的表達，進而減少母體對胎兒的免疫排斥，增加胚胎植入的成功率。朱喆[42]利用qPCR和Western blot技術(shù)對妊娠9～20 d的奶牛子宮內(nèi)膜組織進行分析，發(fā)現(xiàn)相較于未妊娠奶牛，妊娠早期奶牛子宮內(nèi)膜組織的IFN-τ轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。Green等[43]檢測妊娠與未妊娠奶牛外周血白細胞干擾素tau刺激基因(ISGs)的表達，發(fā)現(xiàn)在妊娠18 d(約1歲)的初產(chǎn)母牛中，ISGs的表達顯著增加，但是年齡較大的奶牛，在妊娠18 d時對ISG診斷的敏感性較低。Yoshino等[44]通過檢測外周血白細胞ISGs的表達豐度，對受精3周的日本黑牛進行早期妊娠診斷，陽性診斷準確率和陰性診斷準確率分別為80%和94.6%。

Ahmad等[45]通過中性粒細胞裂解物ELISA檢測表明，妊娠牛血清ISG濃度顯著高于非妊娠牛，且在妊娠16 d時差異性最高，因此干擾素tau檢測法有望能在母牛配種后16 d進行早期妊娠診斷。IFN-τ在反芻動物妊娠診斷上的研究才剛剛起步，相比于其他的免疫學診斷，干擾素tau 在牛早期妊娠診斷上的報道少之又少，將來隨著研究的深入，干擾素tau檢測法可能會像PAGs檢測法一樣，成為一種熱門的牛早期妊娠診斷技術(shù)。

3 展望

妊娠期間，胎兒與母體發(fā)生一系列互作，導致妊娠母牛與未妊娠母牛體內(nèi)生理生化指標產(chǎn)生顯著差異，基于這些差異建立了多種早期妊娠診斷方法，但都不能滿足當代養(yǎng)牛業(yè)的需求。直腸觸診需要豐富的臨床經(jīng)驗，易造成誤診，且診斷時間晚，無法在配種后18～21 d內(nèi)作出準確診斷；超聲波診斷不僅需要熟練的操作技術(shù)，還受到儀器設(shè)備昂貴的限制；免疫學診斷大都存在操作復雜、耗時長或有放射性危害等缺陷，很難在養(yǎng)殖場內(nèi)推廣使用。開發(fā)出一個理想化的母牛早期妊娠診斷方法是畜牧研究者關(guān)注的熱點話題，近年來，互聯(lián)網(wǎng)+農(nóng)業(yè)模式飛速發(fā)展，畜牧養(yǎng)殖業(yè)越來越智能化，機電傳感和遙感技術(shù)也被應用于畜牧領(lǐng)域，根據(jù)母牛配種后的行為、溫度、體重等生理變化進行早期妊娠診斷是未來的一個趨勢，其優(yōu)點在于不必接觸母牛便可進行早期妊娠診斷，這種自動化的診斷方法既不會對胎兒造成損害又減少了母體的應激，同時還可以準確的監(jiān)測返情，進一步提高母牛的繁殖效率[46]。另外，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的妊娠相關(guān)因子(如血清外泌體miRNA等)被發(fā)掘出來，這些生物標識物不僅能預測妊娠，還與一些疾病密切相關(guān)，因此通過檢測妊娠相關(guān)標識物進行早期妊娠診斷會有很大的學術(shù)價值與應用前景[47]。