楊春杰，秦毅斌，陳櫻，韋祖樟，黃偉堅(jiān)，趙武，歐陽(yáng)康*

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2. 廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530005)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，臨床上該病以水樣腹瀉、脫水以及嘔吐為主要特征[1]。1971年，PED在英國(guó)被首次報(bào)道，隨后波及世界上多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，Debouck和Pensaert首次分離得到PEDV毒株并命名為CV777。2010年，PEDV的變異毒株在我國(guó)出現(xiàn)，并迅速在豬群內(nèi)流行，造成了大規(guī)模的PED暴發(fā)[2-3]。2013年美洲首次暴發(fā)PED，隨后蔓延至加拿大、墨西哥等北美國(guó)家，造成仔豬死亡超過(guò)700萬(wàn)頭[4-5]。2014年初，韓國(guó)、日本等亞洲國(guó)家與中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)相繼暴發(fā)嚴(yán)重的PED疫情。截至目前，PEDV已經(jīng)席卷亞洲、歐洲、美洲的大部分國(guó)家與地區(qū)[6-7]，給世界生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。

PEDV是冠狀病毒科、α冠狀病毒屬的成員，為單股正鏈RNA病毒，呈球形，直徑約95～190 nm，病毒基因組全長(zhǎng)約為28 kb[8-9]。PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白有纖突(S)蛋白、小膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白，S蛋白在介導(dǎo)病毒入侵和誘導(dǎo)中和抗體的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]，當(dāng)病毒進(jìn)入機(jī)體后，宿主細(xì)胞可以將S蛋白裂解為S1和S2兩個(gè)亞基，其中S1亞基有助于識(shí)別上皮細(xì)胞受體，S2亞基有助于病毒與上皮細(xì)胞胞膜的融合[11-12]。一些研究表明，S基因?qū)EDV的生物學(xué)特性有較大的的影響，該基因與PEDV毒株的遺傳進(jìn)化、毒力改變等有著密切的關(guān)系[13-15]。

本研究通過(guò)對(duì)廣西某規(guī)?；i場(chǎng)腹瀉病例進(jìn)行臨床診斷，并對(duì)感染豬群的PEDV毒株(命名為：CH/GXYL/2018)S基因進(jìn)行序列測(cè)定與分析，為分析廣西地區(qū)PEDV遺傳變異情況，以及科學(xué)有效地防控PED提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒，購(gòu)自上海百賽生物深圳分公司；AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；GreenTaqMix、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA Marker購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 發(fā)病情況與臨床樣品采集

病料來(lái)自廣西玉林市某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)。該豬場(chǎng)生產(chǎn)母豬存欄規(guī)模約1 000頭，2018年10月之前豬場(chǎng)從未使用過(guò)腹瀉疫苗，豬場(chǎng)內(nèi)也未出現(xiàn)過(guò)腹瀉疫情。2018年10月1日與2018年11月1日，對(duì)母豬群兩次普免豬流行性腹瀉病毒(AJ1102疫苗株)與豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)二聯(lián)弱毒活疫苗。11月15日，哺乳舍母豬和14～16日齡的仔豬同時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀，至當(dāng)月18日左右腹瀉疫情逐漸加重，截止到12月11日，哺乳仔豬發(fā)病率約為50%，不同棟舍哺乳仔豬死亡率在5.5%～19.3%之間，保育豬和育肥豬未出現(xiàn)腹瀉疫情。2018年12月16日，無(wú)菌采集腹瀉仔豬的小腸送至本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)。無(wú)菌條件下取腹瀉仔豬小腸內(nèi)容物，用PBS溶液進(jìn)行稀釋，并以5 000 r/min離心5 min，收集上清并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 臨床診斷與病理剖檢

對(duì)發(fā)病豬群的臨床癥狀進(jìn)行觀察；對(duì)發(fā)病死亡的哺乳仔豬進(jìn)行病理解剖，重點(diǎn)觀察仔豬的胃、小腸和腸系膜淋巴結(jié)的病變情況。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參考文獻(xiàn)[16]的方法設(shè)計(jì)一對(duì)PEDV檢測(cè)引物，目的片段長(zhǎng)度為492 bp；參考文獻(xiàn)[17]設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增PEDV S基因的引物，目的片段長(zhǎng)度為4 430 bp(引物位置參考CHGD-01)，該引物擴(kuò)增的目的基因片段包含PEDV S基因的全長(zhǎng)序列(表1)。引物均由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

臨床樣品經(jīng)12 000 r/min 4 ℃ 離心5 min后，按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提病毒總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為：5×Buffer 2.5 μL，dNTP mix 1 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 0.25 μL，RNasin酶抑制劑0.25 μL，下游引物0.5 μL，RNA 8 μL。42 ℃ 反應(yīng)1 h，cDNA產(chǎn)物于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 臨床樣品的PCR檢測(cè)

PEDV PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為：GreenTaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，cDNA模板 3 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。同時(shí)，參考王睿敏等[18]的方法，對(duì)引起豬腹瀉的常見(jiàn)病原TGEV、豬輪狀病毒(PRoV)、豬Delta冠狀病毒(PDCoV)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.7 S基因PCR擴(kuò)增與測(cè)序

以病毒的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，cDNA 3 μL，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增條件為：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、53 ℃ 15 s、72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將得到的目的片段進(jìn)行純化，并將純化后的產(chǎn)物送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 S基因生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DNAStar-SeqMan軟件，將測(cè)序得到的S基因進(jìn)行拼接，得到PEDV的S基因全長(zhǎng)序列。應(yīng)用DNAStar-MegAlign軟件，將PEDV S基因序列與GenBank上發(fā)表的32條PEDV毒株S基因參考序列(表2)，進(jìn)行比對(duì)分析，并利用Mega 5.0軟件，采用Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)遺傳發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。應(yīng)用ProtScale軟件分析S蛋白疏水性，應(yīng)用Protean軟件分析S蛋白抗原指數(shù)。

表2 PEDV參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察與病理剖檢

經(jīng)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，腹瀉仔豬表現(xiàn)為精神沉郁，體型消瘦，體毛凌亂且皮膚多被腹瀉物污染，仔豬多在2～8日齡出現(xiàn)不同程度的腹瀉，新生仔豬最早可在出生當(dāng)天出現(xiàn)腹瀉，7日齡內(nèi)的仔豬在發(fā)病后3～4 d多因嚴(yán)重脫水而死亡。腹瀉仔豬多伴隨嘔吐癥狀，糞便呈灰黃色或灰白色?；疾∧肛i表現(xiàn)為食欲下降、精神不振，但是腹瀉癥狀較輕。腹瀉疫情只出現(xiàn)在產(chǎn)房，耐過(guò)后的仔豬死亡率較低。

剖檢腹瀉死亡的哺乳仔豬，在其胃內(nèi)可見(jiàn)大量的凝乳塊(圖1)，仔豬主要病變?yōu)樾∧c腫脹擴(kuò)張(圖2)，腸壁變薄并且缺乏彈性，腸系膜充血，在腸道內(nèi)可見(jiàn)大量的黃色液體，腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸黏膜有出血點(diǎn)。

圖1 哺乳仔豬胃內(nèi)充滿凝乳塊

圖2 小腸腫脹擴(kuò)張充滿黃色液體

2.2 臨床樣品RT-PCR檢測(cè)

對(duì)臨床腹瀉樣品進(jìn)行PEDV RT-PCR擴(kuò)增，將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果擴(kuò)增出492 bp的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致(圖3)，說(shuō)明臨床樣品存在PEDV的感染，同時(shí)對(duì)TGEV、PRoV和PDCoV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

M. DL 2000 Marker；1. 陰性對(duì)照；2. 陽(yáng)性樣品

2.3 S基因擴(kuò)增

以病毒的cDNA為模板，進(jìn)行PEDV的S基因PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期大小一致的目的條帶(圖4)，將擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行純化，并將純化后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序序列經(jīng)與NCBI上公布的PEDV參考株序列比對(duì)，確認(rèn)得到了S基因的全長(zhǎng)序列,并將其來(lái)源毒株命名為CH/GXYL/2018毒株。

M. DL 5000 Marker；1. 陰性對(duì)照；2. S基因擴(kuò)增

2.4 綜合診斷

通過(guò)對(duì)發(fā)病豬群的流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀和病理變化的觀察，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室分子診斷技術(shù)等的綜合分析，初步診斷此次疫情是由PEDV感染引起。

2.5 S基因序列分析

2.5.1 S基因同源性與遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用DNAStar-SeqMan軟件對(duì)CH/GXYL/2018毒株的S基因進(jìn)行比對(duì)和拼接，結(jié)果顯示，CH/GXYL/2018毒株的S基因全長(zhǎng)4 158 nt，編碼1 385 aa。應(yīng)用MegAlign軟件，將CH/GXYL/2018毒株的S基因核苷酸序列，與GenBank上發(fā)表的32株P(guān)EDV參考毒株的S基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，CH/GXYL/2018與國(guó)內(nèi)外參考毒株S基因比對(duì)，核苷酸同源性為92.8%～99.5%，氨基酸同源性為91.8%～99.2%(表3)。CH/GXYL/2018與中國(guó)疫苗株AJ1102的S基因核苷酸同源性為98.9%，與中國(guó)廣東GD-A株S基因核苷酸同源性高達(dá)99.5%，與廣西地區(qū)分離株CH-GX-2015-750A的S基因核苷酸同源性為97.4%，而與ZJU-G1-2013毒株的核苷酸同源性僅為92.8%。

表3 S基因同源性比對(duì)結(jié)果

用CH/GXYL/2018與GenBank上發(fā)表的國(guó)內(nèi)外PEDV參考毒株，構(gòu)建S基因核苷酸遺傳發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖5顯示。PEDV毒株形成兩個(gè)較明顯的分支，分為G1與G2型，廣西毒株CH/GXYL/2018與國(guó)內(nèi)PEDV疫苗株AJ1102在同一個(gè)分支上，與FL2013、GD-A毒株的遺傳距離較近，與經(jīng)典疫苗毒株CV777(vaccine)和Attenuated-DR13親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。遺傳進(jìn)化分析表明，CH/GXYL/2018屬于G2-a變異毒株。

▲為本試驗(yàn)獲得的S基因序列；●為疫苗株S基因序列

2.5.2 S基因突變位點(diǎn)分析

應(yīng)用MegAlign軟件，將CH/GXYL/2018毒株的S基因核苷酸序列與中國(guó)G2型疫苗參考株AJ1102進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CH/GXYL/2018毒株的S基因共有37個(gè)核苷酸發(fā)生了突變，共造成14個(gè)氨基酸變異。將廣西地區(qū)CH/GXYL/2018毒株的S基因氨基酸與19株國(guó)內(nèi)外PEDV參考毒株進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，CH/GXYL/2018與中國(guó)G2型疫苗參考株AJ1102有多處相同的氨基酸突變位點(diǎn)，分別為369位氨基酸處(T→I)、492位氨基酸處(R→T)、501位氨基酸處(I→T)、1 212位氨基酸處(F→Y)、1 220位氨基酸處(S→G)、1 270位氨基酸處(P→S)。比對(duì)結(jié)果中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)S基因氨基酸的插入或缺失，S基因氨基酸主要突變位點(diǎn)為：216位氨基酸處(M→I)、768位氨基酸處(P→R)、1 242位氨基酸處(D→E)，在807、827、890、894、1 379、1 384位氨基酸處，CH/GXYL/2018的氨基酸突變與參考毒株均不相同(表4)。

表4 S基因氨基酸主要突變位點(diǎn)分析

2.5.3 S蛋白疏水性與抗原性分析

應(yīng)用ProtScale軟件，對(duì)CH/GXYL/2018的S蛋白的疏水性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S蛋白在第1 336 aa位點(diǎn)的疏水性數(shù)值最大，為3.978；在第1 210 aa位點(diǎn)的疏水性數(shù)值最小，為-2.611。與參考毒株中的AJ1102相比，S蛋白第807位氨基酸從絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，?27位氨基酸從谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸，而導(dǎo)致該區(qū)域的疏水性發(fā)生了較大的變化(圖6)。

A. CH/GXYL/2018 S基因疏水性；B. AJ1102 S基因疏水性

應(yīng)用Protean軟件，根據(jù)Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)CH/GXYL/2018 S蛋白抗原指數(shù)，并與國(guó)內(nèi)外發(fā)表的5株G2型PEDV參考毒株S蛋白抗原指數(shù)進(jìn)行差異性分析。分析結(jié)果顯示，由于氨基酸的突變，廣西地區(qū)CH/GXYL/2018毒株的S蛋白抗原指數(shù)在800～813 aa區(qū)域發(fā)生了明顯的改變，說(shuō)明廣西地區(qū)CH/GXYL/2018毒株在該區(qū)域的抗原性發(fā)生了較大變化(圖7)，與參考毒株中的AJ1102相比，CH/GXYL/2018的抗原性在767～772 aa區(qū)域也出現(xiàn)了變化。

圖7 S蛋白抗原指數(shù)預(yù)測(cè)分析結(jié)果

3 討論

自PEDV被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該病毒給世界上很多國(guó)家和地區(qū)的生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的沖擊。截止目前，PED的流行范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，給豬群健康造成較大的威脅。本研究通過(guò)臨床觀察、病理解剖以及實(shí)驗(yàn)室RT-PCR檢測(cè)，對(duì)廣西玉林市某規(guī)?；i場(chǎng)豬群腹瀉進(jìn)行了確診，綜合分析發(fā)現(xiàn)，本次疫情是由PEDV變異株感染哺乳母豬和哺乳仔豬所引起的。流行病學(xué)調(diào)查顯示，雖然豬場(chǎng)曾對(duì)母豬群兩次普免PEDV與TGEV二聯(lián)弱毒活疫苗(PEDV疫苗株為AJ1102)，但是豬群依然出現(xiàn)了PEDV變異株感染的疫情，表明疫苗并沒(méi)有對(duì)豬群提供完全保護(hù)。通過(guò)對(duì)本案例分析發(fā)現(xiàn)，豬群第2次普免二聯(lián)弱毒活疫苗的時(shí)間為產(chǎn)前一周之內(nèi)，母豬上產(chǎn)房后，PEDV抗體水平?jīng)]有得到有效提升，仔豬不能得到有效保護(hù)，疫苗的免疫時(shí)機(jī)也可能是造成這次疫情出現(xiàn)的重要因素。2018年10月之前豬場(chǎng)沒(méi)有腹瀉發(fā)生，豬場(chǎng)環(huán)境中PEDV的含量很低，通過(guò)必要的消毒措施進(jìn)行控制，加上合理的飼養(yǎng)管理，可以給豬群提供日常保護(hù)。通過(guò)腹瀉疫苗對(duì)豬群的普免，能夠很好地建立起豬群的免疫屏障，但是一旦部分豬群免疫水平低下，PEDV對(duì)豬群形成有效感染，發(fā)病豬群向環(huán)境中排放大量的病毒，豬的抗體難以抵抗大劑量強(qiáng)毒攻擊時(shí)就會(huì)形成豬群發(fā)病[19]。另外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在豬群發(fā)病期間，當(dāng)?shù)赜羞B續(xù)多天的陰雨天氣，晝夜溫差較大，環(huán)境突變也可能是PED暴發(fā)的影響因素。疫病發(fā)生后，豬場(chǎng)并沒(méi)有果斷采取消滅傳染源、切斷病毒在單元間的傳播途徑等措施，從而導(dǎo)致了PEDV在場(chǎng)區(qū)的傳播。

PEDV的S蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在病毒粒子通過(guò)膜融合入侵到宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，S基因的突變還能夠引起PEDV的不斷進(jìn)化與病毒毒力的改變[20-21]。根據(jù)PEDV S基因N末端結(jié)構(gòu)域的不同，可以將PEDV分為G1與G2型[22]。本研究在遺傳進(jìn)化分析中發(fā)現(xiàn)，CH/GXYL/2018與FL2013、GD-A有著較近的遺傳距離，屬于PEDV G2-a變異型毒株。氨基酸突變位點(diǎn)分析顯示，CH/GXYL/2018與中國(guó)G2型疫苗參考株AJ1102也有多處相同的氨基酸突變位點(diǎn)，但是在807、827、890、894、1 379、1 384位氨基酸處，廣西CH/GXYL/2018毒株的氨基酸突變與參考毒株均不相同，至于這些突變位點(diǎn)對(duì)病毒致病性的影響，尚有待于進(jìn)一步深入研究。核苷酸同源性分析顯示，CH/GXYL/2018與疫苗株CV777的核苷酸同源性僅為93.2%，在59～62位氨基酸處CH/GXYL/2018有氨基酸的連續(xù)插入，在159～160位氨基酸處存在氨基酸的缺失，與前人的研究結(jié)果相似[23-26]。CH/GXYL/2018與廣東毒株GD-A的核苷酸同源性達(dá)到99.5%，并且多處氨基酸突變位點(diǎn)相一致。另外，本研究還對(duì)S蛋白的疏水性和抗原指數(shù)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，CH/GXYL/2018的變化位點(diǎn)多集中在800～827位氨基酸處，這與氨基酸突變位點(diǎn)分析相一致，推測(cè)CH/GXYL/2018的S蛋白結(jié)構(gòu)在此處發(fā)生了較大的變化。

隨著PEDV在世界各國(guó)和地區(qū)之間流行范圍的不斷擴(kuò)大，毒株出現(xiàn)了不同程度的變異，目前變異株疫苗在養(yǎng)豬生產(chǎn)中已得到了廣泛的應(yīng)用，但是由于該病毒變異進(jìn)化較快[27]，免疫失敗的案例依然時(shí)有發(fā)生。在對(duì)PED的防控中，及時(shí)開(kāi)發(fā)并應(yīng)用與PEDV流行毒株相一致的疫苗依然具有重要意義。由于PEDV感染后沒(méi)有很好的治療方法，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)以預(yù)防為主，建立完善的豬場(chǎng)生物安全體系尤為必要。豬流行性腹瀉多發(fā)生在氣溫寒冷的冬春季節(jié)，因此，生產(chǎn)中應(yīng)注意冬春季節(jié)仔豬的防寒保暖，加強(qiáng)對(duì)仔豬的飼養(yǎng)管理，提升豬群的抵抗力，從根源上杜絕PEDV對(duì)豬群的感染。