范永超，劉海隆，施曉杰，張倩，馮波，穆祥*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 102206；2. 海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南 ?？?571100；3. 中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081)

仔豬水腫病(edema disease，ED)是一種多發(fā)于斷奶仔豬的細(xì)菌性疾病，主要由產(chǎn)志賀樣毒素大腸埃希菌(Shiga toxigenicEscherichiacoli，STEC)引起，初步視診可觀察到頭部水腫、腹瀉并伴有共濟(jì)失調(diào)、站立不穩(wěn)和驚厥等神經(jīng)癥狀，剖檢可見腸系膜、胃壁水腫并伴有出血[1]。該病發(fā)病急，病死率高且目前尚未有特效藥，極大的影響了仔豬生長發(fā)育，嚴(yán)重影響了經(jīng)濟(jì)效益。大腸埃希菌O138、O139、O141等血清型可引起該病，其中以O(shè)139最為常見[2]。該病主要毒力因子是F18ab菌毛和志賀樣毒素二型變異體(Shiga-like toxin IIe,SLT-IIe)[3]。SLT-IIe是由一個(gè)具有酶活性的A亞單位被一個(gè)識別特定糖脂受體的B亞單位的五聚體包圍組成的，A亞單位進(jìn)入宿主細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用[4]。細(xì)菌通過F18ab菌毛定植在小腸上皮細(xì)胞并釋放SLT-IIe，SLT-IIe侵害血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放并引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，造成以腸道為主的多器官損傷，全身水腫和神經(jīng)癥狀[4-5]。本試驗(yàn)以豬為試驗(yàn)動物進(jìn)行攻毒和攻菌，通過臨床觀察、病理解剖及組織學(xué)觀察，證明該方法成功模擬了自然感染下仔豬水腫病的病理狀態(tài)，為基于仔豬水腫病辨證分型新技術(shù)的建立和中獸藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與毒素

大腸埃希菌CVCC1519，血清型為O139，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；SLT-IIe由本試驗(yàn)室提取保存，濃度為721.75 μg/mL。

1.2 主要試劑

蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(批號為C0105)，購自碧云天生物技術(shù)公司；4%多聚甲醛(批號為BL539A)，購自西安風(fēng)騰生物有限公司；注射用生理鹽水(批號為HG/T3491-1999)，購自四川科林藥業(yè)股份有限公司；中性樹膠(批號為10004160)，購自四川科林藥業(yè)股份有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基由獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)試驗(yàn)室配置保存。

1.3 試驗(yàn)動物及分組

試驗(yàn)動物長白一元仔豬(25～30日齡)，購自北京原種豬場。

選體重5～8 kg長白一元斷奶仔豬15頭，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。試驗(yàn)前對斷奶仔豬進(jìn)行稱重，設(shè)3個(gè)處理組，每組5只。對照組腹腔注射生理鹽水1.2 mL/kg，毒素組腹腔注射SLT-IIe毒素溶液0.7 mg/kg，細(xì)菌組腹腔注射1×1010CFU/mL的菌液1.2 mL/kg。

1.4 臨床指標(biāo)采集

對各組仔豬進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測，臨床觀測指標(biāo)為精神、皮毛色澤、活動、飲食、糞便、舌色。

1.5 病理剖檢及組織學(xué)檢測

在病程發(fā)展最高峰時(shí)，對各組半數(shù)仔豬及死亡仔豬進(jìn)行剖檢取樣，觀察記錄臟器表觀病理變化，剖檢胃、小腸，對其內(nèi)容物及黏膜進(jìn)行觀察；取相同部位相同大小的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、空腸、胃進(jìn)行組織固定，HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)檢測。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

對照組無明顯臨床癥狀，細(xì)菌組及毒素組表現(xiàn)出面部水腫、神經(jīng)癥狀等明顯水腫病特征性癥狀，具體如表1所示。

表1 臨床癥狀

2.2 病理剖檢

由剖檢可見，對照組腸道和胃無明顯病理變化(圖1A、圖1D)；毒素組和細(xì)菌組仔豬腹腔有纖維樣滲出及黃色澄明液體，液體暴露于空氣后凝固成膠凍；十二指腸及空腸腸壁腫脹變薄，呈紅褐色，腸內(nèi)容物為紅棕色黏稠液體，腸黏膜脫落，彌漫性出血，結(jié)腸系膜呈透明膠凍樣水腫(圖1B、圖1C)；胃壁水腫，胃黏膜紅腫，嚴(yán)重充血、出血，胃底部彌漫性出血，胃內(nèi)有黃色膠凍，胃黏膜層與肌層易分離，可見水腫液流出(圖1E、圖1F)。

A. 對照組腸道;B. 毒素組腸道;C. 細(xì)菌組腸道;D. 對照組胃;E. 毒素組胃;F. 細(xì)菌組胃

2.3 病理組織學(xué)檢測結(jié)果

2.3.1 肝臟

對照組肝臟組織完整，中央靜脈結(jié)構(gòu)清晰，可見清晰的肝小葉和排列整齊的肝索(圖2A)；毒素組肝小葉中央靜脈擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞，肝索紊亂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞破裂(圖 2B)；細(xì)菌組肝小葉中央靜脈擴(kuò)張，肝索紊亂，肝臟組織水腫(圖 2C)。

A. 對照組；B. 毒素組；C. 細(xì)菌組

2.3.2 空腸

對照組小腸絨毛清晰可見，未發(fā)生脫落，腸黏膜及固有層結(jié)構(gòu)正常(圖 3A)；毒素組小腸絨毛變短、脫落，腸黏膜下層及固有層水腫，炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增多(圖 3B)；細(xì)菌組小腸絨毛變短、脫落，腸固有層水腫及黏膜下層水腫，腸腺結(jié)構(gòu)破壞，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(圖 3C)。

A. 對照組；B. 毒素組；C. 細(xì)菌組

2.3.3 肺臟

對照組肺臟組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁分界清晰，未見炎性細(xì)胞(圖 4A)；毒素組肺臟組織發(fā)生實(shí)變，肺泡壁腫脹，炎性細(xì)胞增多，間質(zhì)結(jié)締組織增生顯著(圖 4B)；細(xì)菌組肺泡病變區(qū)發(fā)生實(shí)變，肺泡壁腫脹，肺泡腔內(nèi)有中性粒細(xì)胞滲出，肺泡中可見脫落的上皮細(xì)胞，間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張。毒素組肺組織發(fā)生實(shí)變，肺泡壁腫脹，炎性細(xì)胞增多，間質(zhì)結(jié)締組織增生顯著(圖 4C)。

A.對照組；B. 毒素組；C. 細(xì)菌組

2.3.4 胃

對照組胃壁黏膜完整清晰，胃小凹組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊(圖 5A)；毒素組胃黏膜腺體和固有層有炎性細(xì)胞浸潤，下層結(jié)構(gòu)疏松，結(jié)締組織水腫(圖 5B)；細(xì)菌組胃黏膜萎縮，結(jié)構(gòu)紊亂，黏膜下層結(jié)構(gòu)疏松，炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織水腫(圖 5C)。

A.對照組；B. 毒素組；C. 細(xì)菌組

2.3.5 脾臟

對照組脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，脾索、脾竇分界清晰(圖 6A)；毒素組脾臟組織發(fā)生水腫，脾小體結(jié)構(gòu)疏松，充滿粉紅色水腫液，間質(zhì)細(xì)胞增生，吞噬細(xì)胞數(shù)量增多(圖 6B)；細(xì)菌組脾竇擴(kuò)張，血管壁增厚，血管內(nèi)有微血栓，部分區(qū)域淋巴細(xì)胞消失(圖 6C)。

A.對照組；B. 毒素組；C. 細(xì)菌組

2.3.6 腎臟

對照組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小管形態(tài)清晰(圖 7A)；毒素組腎小球內(nèi)細(xì)胞增生，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(圖 7B)；細(xì)菌組腎小球萎縮，腎小管上皮細(xì)胞脫落，大量炎性細(xì)胞浸潤(圖 7C)。

A.對照組；B. 毒素組；C. 細(xì)菌組

3 討論

仔豬水腫病是三大仔豬大腸桿菌病之一，目前我國還尚未有針對此病的特效藥，治療以青霉素、鏈霉素等抗生素為主并輔以安痛定等支持性藥物[6]。隨著2020年國家全面禁抗，獸用抗生素的全面退出，對于替抗藥物的研發(fā)已經(jīng)迫在眉睫，一個(gè)穩(wěn)定有效的動物模型是藥物研發(fā)的重要保障。周宏超等[7]以小鼠為試驗(yàn)動物，通過腹腔注射107/86大腸埃希菌和SLT-IIe毒素成功復(fù)制了仔豬水腫病病理模型。本試驗(yàn)選取斷奶長白仔豬為試驗(yàn)動物誘發(fā)的仔豬水腫病，更加貼近臨床上仔豬水腫病的病例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毒素組與細(xì)菌組的臨床表現(xiàn)基本一致，均出現(xiàn)了精神沉郁、共濟(jì)失調(diào)、肌肉震顫等神經(jīng)癥狀和典型眼瞼、面部水腫等仔豬水腫特征性癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)，毒素組和細(xì)菌組仔豬胃腸病變突出，胃大彎和腸系膜均出現(xiàn)嚴(yán)重的出血水腫。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，各臟器細(xì)胞均有不同程度腫脹甚至破碎，細(xì)胞間出血和炎性細(xì)胞浸潤。其中，胃腸細(xì)胞病變最嚴(yán)重，小腸絨毛萎縮脫落、腸黏膜下層及固有層水腫，胃黏膜萎縮、結(jié)締組織水腫。

在已有報(bào)道中，對仔豬水腫病的研究大都是圍繞胃腸道進(jìn)行的[8-10]，在本試驗(yàn)中，發(fā)病仔豬表現(xiàn)出以胃腸道為主的全身多器官損傷。Yang等[11]研究表明，腸道是該病侵襲的靶器官，小腸上皮細(xì)胞刷狀緣的F18受體是該病的靶點(diǎn)。SLT-IIe是該病的主要毒力因子，本試驗(yàn)也進(jìn)一步證明了這一觀點(diǎn)。SLT-IIe是一種血管毒素，當(dāng)SLT-IIe被腸道吸收進(jìn)入血后，與靶內(nèi)皮細(xì)胞糖脂受體結(jié)合，去除核糖體28S rRNA上特定的腺嘌呤殘基，使核糖體滅活，從而抑制蛋白質(zhì)的合成[12]。SLT-IIe還能從微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核DNA中除去腺嘌呤，造成細(xì)胞DNA損傷，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞變性壞死，導(dǎo)致全身各器官損傷[13]。綜上所述，仔豬水腫病是一種以內(nèi)皮細(xì)胞受損為核心的“血管內(nèi)皮疾病”。因此，開發(fā)出保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的藥物，理論上可以有效治療仔豬水腫病。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)用大腸桿菌O139和SLT-IIe均成功誘發(fā)了仔豬水腫病，且SLT-IIe所誘導(dǎo)的發(fā)病豬在相關(guān)臨床指征上與細(xì)菌組誘導(dǎo)的發(fā)病豬表現(xiàn)出一致性。研究結(jié)果為該病的診斷、預(yù)防和治療奠定了科學(xué)的理論基礎(chǔ)，并為相關(guān)新獸藥的研發(fā)提供了靶動物模型。