張鵬，劉婷，苗莉云，裴婷，甘喆，耿紅*

(1 中南民族大學 生命科學學院，武漢430074；2 山西中醫(yī)藥大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，晉中 030619)

內(nèi)生菌具有促進宿主植物生長和藥用物質(zhì)合成的作用[1-2].重樓(Parispolyphylla)為百合科重樓屬多年生草本植物，塊狀根為主要入藥部分，一般需5年以上才可入藥.重樓的葉和莖為一年生，資源豐富，可作為根的替代資源開發(fā)皂苷類藥物[3].分析重樓不同組織的內(nèi)生菌多樣性以及從中篩選促生菌株，有助于揭示內(nèi)生菌對宿主生長發(fā)育的影響以及利用內(nèi)生菌改良重樓種植技術(shù).王茜[4]等發(fā)現(xiàn)滇重樓不同組織的內(nèi)生細菌組成差異較大.廖秋紅等[5]從6年生滇重樓全株組織(葉，莖，根狀莖)共分離到49株內(nèi)生細菌，其中莖組織分離到9株，歸屬于2屬5種，其優(yōu)勢菌為芽孢桿菌屬(80.0%).周先治等[6]從4年生華重樓植株的根、莖、葉共分離到65株內(nèi)生細菌，歸屬到11屬23種，其中健康植株的莖中分離到10種內(nèi)生細菌，其優(yōu)勢菌為芽孢桿菌屬(67.1%)；病株莖中分離到8種內(nèi)生細菌，優(yōu)勢菌為假單胞菌(50.3%).同時，宋發(fā)軍等[7]從重樓內(nèi)生細菌中篩選獲得多株可促進小麥種子萌發(fā)的菌株.

本文通過分離滇重樓莖組織的可培養(yǎng)內(nèi)生細菌以及分析各個內(nèi)生細菌的16S rDNA序列，初步揭示其莖組織中內(nèi)生細菌多樣性、菌群結(jié)構(gòu)及其優(yōu)勢類型；并通過與小麥幼苗的共培養(yǎng)篩選促生菌，為利用內(nèi)生菌改良重樓種植技術(shù)的研究提供菌種資源.

1 材料與方法

1.1 材料

5年生滇重樓植株于2018年5月采集自云南省麗江市古城區(qū)七河鎮(zhèn)萬農(nóng)生物科技有限公司的種植基地.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LA和LB培養(yǎng)基用于內(nèi)生細菌的分離和培養(yǎng)，1/2 PDA培養(yǎng)基用于共培養(yǎng)實驗，27F和1492R引物用于內(nèi)生細菌16S rDNA序列的擴增[8].

1.2 內(nèi)生細菌的分離與純化

方法參照文獻[8-9]，新鮮重樓莖組織沖洗干凈后，依次采用70%乙醇、1%次氯酸鈉、75%乙醇各2 min，進行表面消毒，無菌水沖洗5 min后，于無菌條件下剪取0.1 g莖，加入1 mL生理鹽水，輕柔研磨成懸浮液，適當稀釋后涂布在分離培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d.培養(yǎng)過程中，不斷挑取新長出的菌株至新的培養(yǎng)基.之后通過劃線法純化獲得各個內(nèi)生細菌的單克隆.

1.3 內(nèi)生細菌的多樣性分析

方法參照文獻[8]：將各個內(nèi)生細菌分別接種到5 mL LB培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6時，取0.5 μL菌液做模板，采用27F和1492R引物擴增其16S rDNA序列.擴增條件：95 ℃ 10 min；93 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min.擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序.各內(nèi)生細菌的16S rDNA序列分別進行BLAST比對，確定其分類，再用Megan軟件選擇Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 促生菌的篩選

方法參照前期報道[8].取5 μL OD600為0.5～0.6的內(nèi)生細菌培養(yǎng)物加入適量培養(yǎng)基混勻后，均勻涂布在1/2 PDA培養(yǎng)基上，并分別接種表面消毒處理的小麥種子10粒；對照組為相同數(shù)量的小麥種子接種在不涂布內(nèi)生細菌的1/2 PDA培養(yǎng)基.共培養(yǎng)條件為28 ℃、14 h光照/10 h黑暗培養(yǎng)20 d.隨機選取小麥幼苗，測量其株高、根長、根的數(shù)目、鮮重，將導(dǎo)致共培養(yǎng)幼苗的株高增長率≥30%、根長增長率≥30%的內(nèi)生細菌定義為促生菌，增長率=(A-B)/B，其中A為與供試菌株共培養(yǎng)小麥的株高或根長，B為對照組小麥的株高或根長.所有實驗均為5個生物學重復(fù).

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)生細菌的分離、純化

將莖組織研磨液均勻涂布在牛肉膏蛋白胨和LA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過程中不斷分離新長出的細菌，并通過多次劃線純化最終得到128株細菌.同時，為驗證表面消毒方法的效果，本研究也將最后一次清洗莖組織的無菌水涂布在上述培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d后培養(yǎng)基上依然無細菌生長，說明所用表面消毒方法可以有效去除莖組織表面的細菌，因此，本研究所得細菌為來源于莖組織的內(nèi)生細菌.

2.2 內(nèi)生細菌的多樣性分析

16S rDNA序列分析結(jié)果表明，這些內(nèi)生細菌歸屬于3個門(放線菌門、厚壁菌門、變形菌門)，其中厚壁菌門是優(yōu)勢門，占比(比例=目標分類單元的數(shù)量/對應(yīng)分類單元的總數(shù)量)82.8%；4個綱(α變形桿菌綱、丙型變形菌綱、桿菌綱、放線菌綱)，其中桿菌綱是優(yōu)勢綱，占比為82.8%；6個目(黃單孢菌目、假單胞菌目、乳桿菌目、桿菌目、微球菌目、鞘脂單胞菌目)，其中桿菌目為優(yōu)勢目，占比為77.3%；11個科(黃單孢菌科、假單胞菌科、莫拉氏菌科、鞘脂單胞菌科、肉桿菌科、氣球菌科、類芽孢桿菌科、芽孢桿菌科、微球菌科、微桿菌科、亮桿菌科)，其中芽孢桿菌科是優(yōu)勢科，占比為75.8%；14個屬(寡養(yǎng)單胞菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、肉食桿菌屬、氣球菌屬、類芽孢桿菌屬、奇異假芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、微球菌屬、節(jié)桿菌屬、微桿菌屬、亮桿菌屬、類節(jié)桿菌屬)(圖1)，其中芽孢桿菌屬是優(yōu)勢屬，占比75.0%，而寡養(yǎng)單胞菌屬、假單胞菌屬、鞘脂單胞菌屬、肉食桿菌屬、奇異假芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、亮桿菌屬是劣勢屬，占比均較低(圖2).

圖1 基于16S rDNA序列的滇重樓莖中內(nèi)生細菌的多樣性分析

圖2 滇重樓莖中內(nèi)生細菌的屬水平的分類

值得注意的是本研究分離內(nèi)生細菌數(shù)量明顯高于文獻報道的華重樓[6]和滇重樓[5].可能原因之一是與植物材料的種植地區(qū)及生長年限有關(guān)，本研究的重樓材料是5月份采集自云南麗江的5年生植株，而周先治等[6]的華重樓材料是6月份采集自福建崇仁的4年生植株，廖秋紅等[5]的滇重樓材料是10月份采集自大理彌渡的6年生植株.另一個可能原因是與使用重樓材料的數(shù)量及內(nèi)生細菌的分離方法有關(guān)，本研究是將0.1 g莖組織輕柔研磨后，適當稀釋，并全部涂布于兩種培養(yǎng)基進行內(nèi)生細菌的分離；而廖秋紅等[5]將重樓組織磨碎后，轉(zhuǎn)移到5 mL LB培養(yǎng)基并在37 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 h～3 h，對培養(yǎng)物進行稀釋并取100 μL稀釋液涂布在LB平板培養(yǎng)基上進行內(nèi)生細菌的分離，但并沒有提到用多少材料來進行內(nèi)生細菌的分離；周先治等[6]將樣品表面消毒后并充分研磨，無菌水稀釋后，取200 μL稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨平板進行內(nèi)生細菌的分離，但也沒有說明用多少材料來進行內(nèi)生菌的分離.

2.3 促生菌的篩選

將128株內(nèi)生細菌分別與小麥幼苗共培養(yǎng)20 d，發(fā)現(xiàn)10株內(nèi)生細菌可以與小麥幼苗共生長(部分結(jié)果如表1)，不引起小麥幼苗衰亡.但是，其中6株內(nèi)生細菌的促生效果不明顯，例如，菌株YNS31013與小麥幼苗共培養(yǎng)20 d后，其共培養(yǎng)小麥幼苗株高和根長的增長率分別是對照的26.1%和40%，其促進效果沒有達到本文對促生菌的要求.

4株內(nèi)生細菌的促生效果明顯(表1).YNS21026和YNS21022對小麥株高的促進效果最好，與對照[(9.75±2.1)cm]相比，株高的增長率分別是87.2%和76.2%.YNS21026和YNS11005對小麥根長促進效果最好，與對照[(0.75±0.3)cm]相比，根長的增長率分別是 310%和167%.YNS21022和YNS21026對小麥鮮重增加效果最好，與對照相比，鮮重的增長率分別是105.4%和99.7%.而YNS32034對小麥幼苗的株高、根長和鮮重的促進效果，弱于YNS21026、YNS21022、YNS11005，但也達到本文對促生菌的要求，與其共培養(yǎng)的小麥幼苗的株高、根長的增長率分別是43.2%、119%.

表1 滇重樓莖中內(nèi)生細菌對小麥幼苗的促生作用

芽孢桿菌、假單胞菌和類芽孢桿菌是常見促生菌.分離自擬南芥根部的芽孢桿菌(UCMB5033、UCMB5036、UCMB5113和FZB42)可促使擬南芥植株的鮮重增加約2倍[10].分離自土壤的芽孢桿菌(菌株A8、B5、C5 和C9)可誘導(dǎo)吲哚乙酸(IAA)相關(guān)基因的表達從而促進擬南芥的生長[11].分離自水稻根際的假單胞菌A15可促進水稻根干重增加5倍[12]；分離自廢水的假單胞菌KUJM可產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)并增強扁豆種子發(fā)芽的潛力[13]；分離自花生根際土壤的類芽孢桿菌YZ29可產(chǎn)生鐵載體和促進花生的生長[14],分離自忍冬的類芽孢桿菌菌株122和130可促進小麥根長增長10%[15].而本研究所獲得的芽孢桿菌YNS21026和假單胞菌YNS21022分別促進小麥株高增長87.2%和76.2%；芽孢桿菌YNS21026和類芽孢桿菌YNS11005分別促進小麥根長增長310%和167%；假單胞菌YNS21022和芽孢桿菌YNS21026分別促進小麥鮮重增長105.4%和99.7%.這些促生菌株為深入研究內(nèi)生細菌的促生機理以及進一步利用促生菌改良重樓種植技術(shù)的研究提供了菌種資源.

3 結(jié)語

本研究從云南麗江采集的5年生重樓的0.1 g莖中分離到128株內(nèi)生細菌，其優(yōu)勢菌為芽孢桿菌屬(75.0%).通過與小麥共培養(yǎng)所得4株促生菌中，芽孢桿菌YNS21026對小麥的株高、根長促進效果最好，增長率分別是87.2%、310%；假單胞菌YNS21022對小麥鮮重增加促進效果最好，增加率是105.4%.這些結(jié)果預(yù)示芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的內(nèi)生細菌與重樓莖組織的生長發(fā)育等關(guān)系緊密.