熊流新，陸麗苗，梁啟蘭，黃志偉，李淑英，盤國雄，鐘建輝，陳亞寬

廣東省肇慶市第二人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.呼吸科，廣東肇慶 526060

肺炎克雷伯菌(KP)是引起醫(yī)院內(nèi)感染和社區(qū)感染的重要條件致病菌，可導(dǎo)致多個(gè)系統(tǒng)尤其是呼吸系統(tǒng)感染[1]。高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)的特征為高黏性、拉絲試驗(yàn)陽性，可導(dǎo)致社區(qū)型肺炎，感染人群主要為青壯年[2]。隨著三代頭孢的廣泛使用，KP的耐藥率逐年上升，且出現(xiàn)了產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌(ESBLsKP)、多重耐藥肺炎克雷伯菌(MDRKP)和耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)，這類KP引起的呼吸道感染已成為臨床關(guān)注的熱點(diǎn)[3-4]。研究表明自然界中絕大多數(shù)細(xì)菌可以產(chǎn)生生物膜，其細(xì)胞外基質(zhì)參與細(xì)菌的黏附、定植過程，生物膜包含的大量黏性基質(zhì)能形成物理屏障，限制抗菌藥物和炎癥細(xì)胞的有效殺傷，生物膜的形成與KP的耐藥性和致病性密切相關(guān)[5-6]。RyhB基因?qū)儆诜蔷幋a小RNA，研究表明RyhB可以被轉(zhuǎn)錄但不能被直接翻譯為蛋白，可通過影響細(xì)菌生物膜的合成來調(diào)節(jié)和影響細(xì)菌致病性[7-8]。本研究通過分析本院呼吸道感染分離的46株KP的耐藥性和生物膜形成能力，同時(shí)檢測RyhB基因，探討不同耐藥表型KP生物膜形成能力與RyhB基因的相關(guān)性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2018年10月至2019年10月不同耐藥表型的46株KP(剔除同一患者的重復(fù)菌株)，對其進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、分離和純化，根據(jù)脈沖場凝膠電泳(PFGE)試驗(yàn)，剔除型別相似度>85%的菌株。

1.2儀器與試劑 Biofosun微生物鑒定藥敏系統(tǒng)、數(shù)字顯示比濁儀購自上海復(fù)星公司；超凈工作臺購自蘇州安泰公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀購自美國Bio-Rad公司；全功能微孔板檢測儀購自美國Bio-Tek公司；qPCR試劑盒購自日本Takara公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；液體LB培養(yǎng)基和血平板購自廣州迪景公司；結(jié)晶紫購自美國Sigma公司；96孔聚苯乙烯滅菌板購自美國Corning公司；RNA引物購自上海生工公司；質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603和大腸埃希菌ATCC25922均購自廣東省臨床檢驗(yàn)中心。

1.3藥敏方法與分組 采用Biofosun微生物鑒定藥敏系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定并使用配套藥敏板測定18種抗菌藥物的最小抑菌濃度，依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會M100-S27藥敏折點(diǎn)判讀結(jié)果。KP耐藥分組參考蘇樂斌等[9]的研究，根據(jù)抗菌藥物的不同耐藥譜將菌株分為4個(gè)耐藥表型。具體分組方法如下：用接種環(huán)輕觸血平板過夜培養(yǎng)的新鮮菌落并向外牽拉，重復(fù)2次，若2次均有黏液絲生成并且長度>5 mm為拉絲試驗(yàn)陽性，判斷為HvKP；按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法同時(shí)使用頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶/克拉維酸，任一藥敏紙片加克拉維酸與不加克拉維酸抑菌環(huán)直徑之差>5 mm，判斷為產(chǎn)ESBLsKP；對亞胺培南耐藥菌株，參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行改良碳青霉烯酶滅活(mCIM)試驗(yàn)，結(jié)果陽性判讀為CRKP；對3類或以上抗菌藥物耐藥，不同于HvKP、產(chǎn)ESBLsKP、CRKP分組標(biāo)準(zhǔn)的菌株歸類為MDRKP。

1.4KP生物膜形成能力的檢測 采用96孔聚苯乙烯滅菌板構(gòu)建KP感染模型，通過結(jié)晶紫染色法定量4種不同耐藥表型的吸光度(A)，具體方法參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。(1)將46株KP轉(zhuǎn)種血平板，挑取單個(gè)菌落于LB培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)24 h；(2)吸取10 μL至LB培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)后把菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，?0 μL菌液接種于含190 μL LB培養(yǎng)液的96孔聚苯乙烯滅菌板(每株設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，設(shè)置未加菌液的LB培養(yǎng)基為空白對照；(3)35 ℃培養(yǎng)48 h后分離上清液，加入200 μL 1%結(jié)晶紫染色液染色20 min，采用ddH2O緩慢沖去未結(jié)合結(jié)晶紫，每孔加200 μL無水乙醇溶解后采用酶標(biāo)儀測定590 nm處A值(平行測定3次，取平均值)；(4)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：AC等于空白孔平均A值加其3倍標(biāo)準(zhǔn)差，當(dāng)A樣≤AC時(shí)，結(jié)果為陰性無生物膜產(chǎn)生；當(dāng)AC4×AC時(shí)結(jié)果為強(qiáng)陽性。

1.5qPCR擴(kuò)增RyhB基因 依照細(xì)菌總RNA提取試劑盒使用說明書提取RNA作為模板。參考文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)RyhB基因引物序列(GT44：5′-GGA TCC GCA AGG GTC TCC CTG-3′，GT45：5′-AGA TCT CGG TTC AGC ATG GCG TAT C-3′)和設(shè)定PCR反應(yīng)條件。qPCR擴(kuò)增RyhB基因過程具體如下：將RNA模板、引物、2×qPCR buffer、Taq Mix溶解后冰上備用，反應(yīng)體系為25 μL：2×qPCR buffer 12.5 μL，正義引物1 μL，反義引物1 μL，RNA模板1 μL，Taq Mix 0.5 μL，ddH2O加至25 μL。震蕩混勻后短暫離心使溶液收集至管底，將熱循環(huán)儀預(yù)熱至45 ℃，qPCR反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄溫度45 ℃，30 min；95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。qPCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在美國國家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1KP的耐藥表型分組及臨床分布 46株KP根據(jù)不同的耐藥譜特征可分為4個(gè)耐藥表型，其中CRKP 6株(占13.0%)，產(chǎn)ESBLsKP 18株(占39.1%)，MDRKP 13株(占28.3%)，HvKP 9株(占19.6%)。46株KP科室來源排名前3為重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)11株(占23.9%)，呼吸科8株(占17.4%)，神經(jīng)外科7株(占15.2%)，見表1。

表1 46株KP的科室分布

2.24種不同耐藥表型KP生物膜形成能力差異分析 5株CRKP為弱陽性、1株CRKP為中等陽性，9株HvKP生物膜形成能力均為弱陽性，18株產(chǎn)ESBLsKP生物膜形成能力均為中等陽性，13株MDRKP生物膜形成能力均為中等陽性。不同組別的生物膜形成能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.444，P<0.05)，CRKP生物膜形成能力低于產(chǎn)ESBLsKP、MDRKP(P<0.05)；HvKP生物膜形成能力低于產(chǎn)ESBLsKP、MDRKP(P<0.05)；CRKP與HvKP比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.802)；產(chǎn)ESBLsKP與MDRKP比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.466)。見表2。

2.34種不同耐藥表型KP的RyhB基因擴(kuò)增電泳結(jié)果分析 產(chǎn)ESBLsKP和MDRKP 存在特異性條帶(大小約200 bp)，CRKP 和HvKP不存在特異性條帶。qPCR擴(kuò)增RyhB基因的陽性產(chǎn)物經(jīng)測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，結(jié)果一致，大小為約200 bp，其中包含了完整的RyhB基因編碼區(qū)(91 bp)位于yhhY和虛擬蛋白ORF之間。見圖1。

2.4RyhB基因表達(dá)與KP生物膜形成能力關(guān)聯(lián)性分析 以生物膜形成能力為因變量，以組別與基因表達(dá)情況的交互項(xiàng)(共4項(xiàng)，其中以組別=MDRKP×RyhB基因表達(dá)=陽性為參照層級，其他層級均與此層級進(jìn)行層內(nèi)的比較，得出偏回歸系數(shù)β)，建立廣義線性回歸方程，偏回歸系數(shù)β用來表示關(guān)聯(lián)程度。對組別=CRKP×RyhB基因表達(dá)=陰性，檢驗(yàn)P<0.05，說明此交互層級對生物膜形成能力的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，β=-0.059，說明當(dāng)組別為CRKP且基因表達(dá)陰性時(shí)，生物膜形成能力相對于參照層平均下降了0.059個(gè)單位，生物膜形成能力呈負(fù)向關(guān)聯(lián)；對組別=HvKP×RyhB基因表達(dá)=陰性，檢驗(yàn)P<0.05，說明此交互層級對生物膜形成能力的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，β=-0.057，說明當(dāng)組別為HvKP且基因表達(dá)陰性時(shí)，生物膜形成能力相對于參照層平均下降了0.057個(gè)單位，與生物膜形成能力呈負(fù)向關(guān)聯(lián)；對組別=產(chǎn)ESBLsKP×RyhB基因表達(dá)=陽性，檢驗(yàn)P>0.05，說明此交互層級對生物膜形成能力的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，在CRKP及HvKP菌株中，RyhB基因表達(dá)為陰性，其與其他組別基因表達(dá)為陽性比較，生物膜形成能力會下降；不同耐藥表型與RyhB基因表達(dá)的交互作用與生物膜形成能力有關(guān)(P<0.05)，且RyhB基因陰性表達(dá)時(shí)，會導(dǎo)致生物膜形成能力下降。見表3。

表2 4種不同耐藥表型KP生物膜形成能力多重比較

注：M泳道為DNA marker；1泳道為陰性對照；2泳道為陽性對照；3～5泳道為CRKP擴(kuò)增條帶；6～10泳道為產(chǎn)ESBLsKP擴(kuò)增條帶；11～14泳道為MDRKP擴(kuò)增條帶；15～16泳道為HvKP擴(kuò)增條帶。

表3 RyhB基因表達(dá)與KP生物膜形成能力的廣義線性模型

3 討 論

KP是呼吸道感染最常見的革蘭陰性條件致病菌，極易導(dǎo)致院內(nèi)感染暴發(fā)。根據(jù)2018年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)結(jié)果顯示KP耐藥率呈逐年上升趨勢，特別是對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率從2005年的3.0%上升至2018年的27.6%，MDRKP和CRKP引起的抗感染治療成為臨床關(guān)注的焦點(diǎn)[12]。

細(xì)菌生物膜由多糖、蛋白質(zhì)等組成，大量的黏性基質(zhì)將細(xì)菌包裹，常規(guī)抗菌藥物往往難以穿透作用于該類細(xì)菌，導(dǎo)致臨床抗菌藥物治療效果差[13]。本研究收集的46株KP經(jīng)過前期的工作，剔除來源同一患者的重復(fù)菌株及PFGE型別相似度>85%的菌株，相比盧鴻等[10]研究同一克隆菌株的KP生物膜形成能力更有臨床意義。彭蓉蓉等[14]研究表明KP生物膜的形成在ICU發(fā)生的概率較高，與本院臨床分布主要在ICU、呼吸科和神經(jīng)外科的結(jié)果一致。本研究通過結(jié)晶紫染色法對4種不同耐藥表型KP生物膜形成能力進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示，4種KP均存在生物膜形成能力，其中產(chǎn)ESBLsKP、MDRKP的生物膜形成能力明顯強(qiáng)于CRKP和HvKP(P<0.05)。DAVIDO等[15]研究顯示，產(chǎn)ESBLsKP和MDRKP是目前醫(yī)院流行的主要致病菌，這表明生物膜形成能力是適應(yīng)外界環(huán)境的重要方式，產(chǎn)ESBLsKP和MDRKP具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，有利于其在醫(yī)院內(nèi)定植及傳播，大量臨床分離菌株的出現(xiàn)與生物膜形成有密切關(guān)系。CRKP為4種不同耐藥表型中耐藥性最強(qiáng)的菌株，但是生物膜形成能力顯示5株CRKP為弱陽性、1株CRKP為中等陽性，這表明KP生物膜形成能力與耐藥性關(guān)系的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

非編碼小RNA基因存在于絕大多數(shù)原核生物中，通常位于基因間區(qū)，具有特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可以被轉(zhuǎn)錄但不能被直接翻譯為蛋白，通過堿基反向互補(bǔ)調(diào)控靶標(biāo)mRNA分子的表達(dá)[16]。細(xì)菌在不同溫度、營養(yǎng)、酸堿度、鐵離子濃度等條件下增殖并適應(yīng)環(huán)境的能力依賴于蛋白質(zhì)類的調(diào)控因子及一些非編碼小RNA的調(diào)控，RyhB最早是在大腸埃希菌中被發(fā)現(xiàn)，屬于非編碼小RNA[17]。腸桿菌科細(xì)菌除沙門菌和鼠疫耶爾森同時(shí)存在RyhB1和RyhB2外，絕大多數(shù)只有1個(gè)RyhB，研究表明，當(dāng)鐵缺乏時(shí)RyhB通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)非必需鐵蛋白的合成，RyhB本身的表達(dá)則受到負(fù)調(diào)控因子Fur的影響以維持體內(nèi)鐵平衡[18]。KP的RyhB大小為91 bp，大腸埃希菌的RyhB大小為90 bp，兩者之間的同源性為92.3%，大腸埃希菌RyhB基因位于yhhX和yhhY之間，而KP的RyhB基因位于yhhY和虛擬蛋白ORF之間。目前美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會還未制訂檢測KP生物膜形成的標(biāo)準(zhǔn)方法，尋找一種快速、靈敏度和特異度均高的可用于臨床標(biāo)本檢測的方法，對生物膜相關(guān)性感染的治療和清除生物膜藥物的篩選有十分重要的臨床意義。本研究采用qPCR法擴(kuò)增4種不同耐藥表型KP的RyhB基因，其中產(chǎn)ESBLsKP和MDRKP 存在特異性條帶，CRKP 和HvKP不存在特異性條帶，通過RyhB基因表達(dá)與KP生物膜形成能力的關(guān)聯(lián)性分析表明，RyhB基因是影響KP生物膜形成的重要調(diào)節(jié)因子之一。