周 美 ,王 瑜 ,李春燕 ,張 明 ,李 青 ,魏福曉 ,王道平*

(1.貴州醫(yī)科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室,貴陽 550014;2.中國科學院 貴州省天然產(chǎn)物化學重點實驗室,貴陽 550014)

李子又名嘉慶子、布霖,薔薇科李屬植物,為核果類水果,廣泛分布于長江流域及西北一帶,在我國有悠久的栽培歷史。李子營養(yǎng)成分豐富,主要包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、核黃素、胡蘿卜素、維生素C及多種微量元素等[1-4]。李子性平,味甘、酸,具有生津止渴、降低血壓、促進消化、清肝除熱、美容養(yǎng)顏等功效[5-7]。近年來,隨著李子種植面積不斷擴大,李子產(chǎn)量大幅度提升,然而李子屬于季節(jié)性水果,鮮果不耐儲藏,且價格較低,因此,如何延伸產(chǎn)業(yè)鏈、提高李子經(jīng)濟附加值是亟待解決的問題。

李子酵素是以李子為原料,加入白砂糖、發(fā)酵劑,經(jīng)過低溫長時間發(fā)酵而產(chǎn)生的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品。在底物發(fā)酵過程中,微生物通過本身的中間代謝,使底物產(chǎn)生一系列的生物化學變化,得到的發(fā)酵產(chǎn)物不僅保留了底物特有的風味和營養(yǎng)成分,還能產(chǎn)生新的氨基酸等生理活性物質(zhì),風味和口感可得到明顯改善[8-10]。開發(fā)李子酵素,可有望解決李子不耐儲藏、附加值低等問題,還能豐富飲料品種,增加果農(nóng)收入。

揮發(fā)性成分是評價水果酵素風味的重要指標[11-12];氨基酸是組成生物體中酶和蛋白質(zhì)的基本單元,其種類和含量是評價食品營養(yǎng)價值的主要指標之一[13-14]。而關(guān)于李子發(fā)酵前后揮發(fā)性成分及游離氨基酸變化的系統(tǒng)性研究較少,因此,本工作采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法(HS-SPMEGC-MS)分析了李子發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的變化,采用氨基酸自動分析儀分析了李子發(fā)酵前后游離氨基酸的種類及含量的變化,以期為李子酵素及相關(guān)產(chǎn)品的綜合開發(fā)利用奠定科學基礎(chǔ)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

HP6890/5975C型GC-MS聯(lián)用儀;Supelco型手動固相微萃取裝置,纖維頭所裝萃取纖維為2 cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex,配25 mL固相微萃取儀采樣瓶;S433D 型全自動氨基酸分析儀,配陽離子分析柱;SKG-PB-936 型打漿機;YLKJ-JCG-500型不銹鋼夾層鍋;AG 285型電子天平;Millipore-0026型超純水機。

磷酸絲氨酸、牛磺酸、磷乙醇氨、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、α-氨基己二酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、α-氨基丁酸、纈氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β-丙氨酸、β-氨基異丁酸、γ-氨基丁酸、組氨酸、3-甲基組氨酸、1-甲基組氨酸、色氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸等31種氨基酸(內(nèi)含其他物質(zhì)尿素和肌肽)混合標準溶液的濃度為100 nmol·L－1。

檸檬酸-檸檬酸鋰緩沖液的pH 分別為2.90,4.20,8.00。

衍生劑茚三酮溶液:20 g·L－1。

氫氧化鋰再生液:0.5 mol·L－1。

白砂糖為食品級;自制復(fù)合型發(fā)酵劑;茚三酮、乙醇、磺基水楊酸均為分析純;發(fā)酵用水為滅菌飲用純凈水,試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 HS-GC-MS

1)HS條件 加熱溫度60 ℃;頂空萃取時間45 min;解吸時間5 min。

2)GC 條件 HP-5MS 色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25μm);汽化室溫度250 ℃,進樣口溫度250℃;載氣為高純氦氣(純度為99.999%),流量1.0 mL·min－1;不分流進樣;溶劑延遲時間1 min。色譜柱升溫程序:初始溫度為40 ℃,保持2 min;以5 ℃·min－1升至270 ℃,保持63 min。

3)MS條件 電子轟擊(EI)離子源,離子源溫度230 ℃;接口溫度250 ℃,四極桿溫度150 ℃;電子能量70 e V;倍增器電壓1 368 V;溶劑延遲時間1 min;掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)29～500。

1.2.2 氨基酸分析

LCAK07/Li型標準分析陽離子型交換樹脂;進樣量50μL;通道1采用的檢測波長為440 nm,用于檢測脯氨酸,通道2采用的檢測波長為570 nm,用于檢測除脯氨酸以外的其他氨基酸;輸液泵壓力0～4.2 MPa;洗脫泵流量0.45 mL·min－1,茚三酮衍生泵流量0.25 mL·min－1;衍生方式為在線衍生;分離柱溫度37 ℃,反應(yīng)器溫度130 ℃;流動相:A 為pH 2.90的檸檬酸-檸檬酸鋰緩沖液;B 為pH 4.20的檸檬酸-檸檬酸鋰緩沖液;C為pH 8.00的檸檬酸-檸檬酸鋰緩沖液;D 為0.5 mol·L－1的氫氧化鋰再生液。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of elution gradient

1.3 試驗方法

1.3.1 李子酵素制備

稱取50 kg洗凈去核新鮮李子樣品,加入等質(zhì)量的滅菌飲用純凈水打漿2 min,將漿液放入不銹鋼夾層鍋中加熱熟化,于90～100 ℃下熬煮8 min后冷卻至室溫,按照其總質(zhì)量的0.03%添加發(fā)酵劑,按照其總質(zhì)量的8%添加白砂糖,攪拌使白砂糖完全溶化,將其轉(zhuǎn)至陶瓷壇內(nèi),用0.154 mm 紗布封口,在18 ℃下發(fā)酵3個月,得到呈淡黃色澄清透明狀的產(chǎn)物;在潔凈度為10 萬級的條件下,用0.45μm 的除菌濾膜于0.1 MPa下加壓過濾,得到李子酵素樣品,于15 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 揮發(fā)性成分試驗

分別稱取3.5 g去核均漿的新鮮李子樣品、7 g李子酵素樣品,置于固相微萃取儀采樣瓶中,按照HS-SPME-GC-MS儀器工作條件分析發(fā)酵前后樣品中的揮發(fā)性成分。

1.3.3 游離氨基酸試驗

新鮮李子樣品打漿5 min,以10 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5 min,取50 mL 上清液用水定容至100.0 mL。取李子汁和李子酵素各25 mL,分別加入100 mL 乙醇,搖勻,靜置30 min,以10 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心15 min,用質(zhì)量分數(shù)為1%磺基水楊酸溶液將上清液定容至5.0 mL,過0.22μm 濾膜,濾液按照氨基酸分析儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 揮發(fā)性成分結(jié)果分析

李子發(fā)酵前后樣品的總離子流圖見圖1。

圖1 李子發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 TIC chromatograms of volatile components before and after fermentation of Prunus salicina Lindl

對照NIST數(shù)據(jù)庫,通過揮發(fā)性成分的質(zhì)譜碎片信息、保留指數(shù)、保留時間等進行定性分析;采用峰面積歸一法進行相對含量統(tǒng)計,結(jié)果見表2。其中峰號82,90,98,101對應(yīng)的化合物屬于烴類化合物;峰號2,4,5,7,9,13,14,16,17,19,28,29,30,48,49,52,58,60對應(yīng)的化合物屬于醇類化合物;峰號1,20,21,27,34,36,43,50,59,64,74,76對應(yīng)的化合物屬于醛類化合物;峰號10,55,83,86,95,96,97,103對應(yīng)的化合物屬于酮類化合物;峰號8,25,37,38,42,67,72對應(yīng)的化合物屬于羰酸類化合物;峰號63,73,80,85,91,99對應(yīng)的化合物屬于酚類化合物;峰號11,35,39,53,54,81對應(yīng)的化合物屬于其他化合物;其他峰號對應(yīng)的化合物屬于酯類化合物。

由表2可以看出:在李子發(fā)酵前后,其中的揮發(fā)性成分種類和含量具有較大差異;新鮮李子中檢出48種揮發(fā)性成分,包括烴類(1種)、醇類(11種)、醛類(9種)、酮類(3種)、羧酸類(1種)、酯類(19種)、酚類(1種)、其他(3種)化合物,其中含量最高的是醇類化合物;李子酵素中共檢出68種揮發(fā)性成分,包括烴類(4 種)、醇 類(11 種)、醛 類(6 種)、酮 類(5種)、羧酸類(6種)、酯類(28種)、酚類(5種)、其他(3種),其中醇類和酯類化合物含量較高。發(fā)酵后的李子酵素中揮發(fā)性成分較發(fā)酵前的共增加了20種,這是李子酵素香氣濃郁的主要原因。

表2 李子發(fā)酵前后揮發(fā)性成分分析結(jié)果Tab.2 Analytical results of volatile components before and after fermentation of Prunus salicina Lindl

表2 (續(xù))

2.2 游離氨基酸結(jié)果分析

2.2.1 色譜行為

31種氨基酸混合標準溶液與發(fā)酵前后樣品的色譜圖見圖2。

2.2.2 標準曲線和檢出限

按照氨基酸分析儀器工作條件對100 nmol·L－1的氨基酸混合標準溶液進行單點外標法測定,以氨基酸的濃度為橫坐標,其對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

按照3倍信噪比(3S/N)計算31種氨基酸的檢出限(3S/N),得到31 種氨基酸的檢出限為0.5～7.9 nmol·L－1。

2.2.3 精密度試驗

按照氨基酸分析儀器工作條件對100 nmol·L－1的氨基酸混合標準溶液進行測定,重復(fù)進樣6次,計算各氨基酸峰面積的相對標準偏差(RSD),所得結(jié)果為0.70%～2.2%,小于3%,表明該方法的精密度良好。

2.2.4 回收試驗

在李子汁和李子酵素中分別加入100 nmol·L－1的氨基酸混合標準溶液,按1.3.3節(jié)制備2種樣品溶液,每種樣品平行制備6份,按照氨基酸分析儀器工作條件分析加標前后的樣品,記錄各氨基酸色譜峰面積,計算李子發(fā)酵前后各游離氨基酸的相對含量,并計算回收率,結(jié)果見表3,其中“*”為必需氨基酸,李子汁和李子酵素中均未檢出α-氨基己二酸和β-氨基異丁酸。

由表3可以看出:李子汁中含有20種游離氨基酸,總量為6 105 mg·L－1,天冬酰胺含量最高,其次是丙氨酸;其中,7種為人體必需氨基酸,13種為非必需氨基酸,必需氨基酸總量為983 mg·L－1,相對含量為16.10%;李子酵素中含24種游離氨基酸,總量為4 127 mg·L－1,丙氨酸含量最高,其次是磷酸絲氨酸;其中,8種為人體必需氨基酸,16種為非必需氨基酸,必需氨基酸總量為1 099 mg·L－1,相對含量為26.63%;李子發(fā)酵前后必需氨基酸種類和含量均增加;和發(fā)酵前的李子相比,李子酵素中游離氨基酸總量降低,這可能與微生物生長消耗部分氨基酸有關(guān);新增了牛磺酸、胱氨酸、蛋氨酸、3-甲基組氨酸、1-甲基組氨酸等5種氨基酸;以李子汁和李子酵素為基質(zhì)得到的加標回收率分別為95.3%～101%和95.5%～101%,表明本方法具有較好的可靠性。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗

按照1.3.3節(jié)方法制備李子汁和李子酵素樣品溶液,并分別于0,4,8,16,24,32 h進樣測定。結(jié)果顯示:31種氨基酸峰面積的RSD(n＝6)為0.70%～2.2%,均小于3%,表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖2 氨基酸混合標準溶液、李子酵素、新鮮李子中游離氨酸酸的色譜圖Fig.2 Chromatograms of free amino acids in amino acid mixed standard solution,enzyme of Prunus salicina Lindl,and fresh Prunus salicina Lindl

表3 回收試驗結(jié)果Tab.3 Results of test for recovery

本方法采用HS-SPEM-GC-MS分析了新鮮李子和李子酵素中的揮發(fā)性成分,李子汁中檢出48種揮發(fā)性成分,李子酵素中共檢出68種揮發(fā)性成分,發(fā)酵后揮發(fā)性成分共增加了20種,使李子酵素的風味和口感得到明顯改善。采用氨基酸分析儀分析了李子汁和李子酵素中游離氨基酸的種類和含量,發(fā)現(xiàn)李子酵素中游離氨基酸的種類比發(fā)酵前的增加了5種,部分氨基酸含量較發(fā)酵前的也有所增加,且人體必需氨基酸占總氨基酸比例較大。本方法可為進一步研究李子酵素香氣物質(zhì)和氨基酸種類增多的機理奠定一定的科學基礎(chǔ),也可為李子酵素產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支撐。