梁秋霞,陳 瀚,黃麗麗,朱健萍,盧日剛

(廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所,南寧 530021)

慶大霉素普魯卡因維B12膠囊是由硫酸慶大霉素、鹽酸普魯卡因、維生素B12等3種原料及適量輔料[內(nèi)含淀粉、玉米淀粉、黏合劑、羧甲基纖維素、硬脂酸鎂、70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液等]組成的復(fù)方口服制劑。每粒慶大霉素普魯卡因維B12膠囊含有20 000單位慶大霉素、0.1 g鹽酸普魯卡因、0.01 mg維生素B12,在臨床上主要用于緩解急、慢性胃炎等,具有消炎、止痛、促進(jìn)胃黏膜修復(fù)等功效?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 第六冊(cè)WS-10001-(HD-0524)－2002《慶大霉素普魯卡因維B12膠囊》、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH 20972006(浙江天瑞)《慶大霉素普魯卡因維B12膠囊》和國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH 15222004(?？谄媪?《慶大霉素普魯卡因維B12膠囊》。維生素B12在該制劑中含量很低,但它作為制劑中的主要成分,其含量是關(guān)鍵控制指標(biāo),但現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)中未設(shè)與維生素B12相關(guān)的鑒別、檢查及含量測(cè)定等項(xiàng)目。為確保用藥安全,需建立準(zhǔn)確、靈敏的分析方法來(lái)測(cè)定該制劑中維生素B12的含量,避免因服用過(guò)量或不足帶來(lái)的危害[1-3]。

藥物制劑中維生素B12含量的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4-7]、原子吸收光譜法[8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[9]、紫外吸光光度法[10]、可見(jiàn)吸收光譜法[11-12]、微生物法[13]等。雖然慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中的維生素B12和鹽酸普魯卡因均是具有共軛結(jié)構(gòu)的水溶性物質(zhì),可采用HPLC中的紫外檢測(cè)器測(cè)定它們的含量,但普魯卡因不影響維生素B12的出峰;慶大霉素在檢測(cè)器上無(wú)響應(yīng),也不會(huì)干擾維生素B12的測(cè)定。文獻(xiàn)[14]采用液相色譜法快速分離和測(cè)定了慶大霉素普魯卡因維B12顆粒中維生素B12的含量,但該方法采用的測(cè)定儀器為裝有1.8μm 小粒徑色譜柱和擴(kuò)展進(jìn)樣環(huán)的超高效液相色譜儀,對(duì)于一般的分析實(shí)驗(yàn)室,尤其是中小型藥物生產(chǎn)企業(yè)實(shí)驗(yàn)室,這種條件要求較高,不能普遍應(yīng)用。由于目前尚未見(jiàn)慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12含量測(cè)定的報(bào)道,本工作采用HPLC測(cè)定了47批慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12的含量,并評(píng)價(jià)了不同廠家生產(chǎn)的相同批次或不同批次樣品中維生素B12的含量均勻度,以期為完善和提高慶大霉素普魯卡因維B12膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器(DAD);KQ-500DB型超聲波清洗器;XS 205DU型電子分析天平;Milli-Q Reference型超純水機(jī)。

維生素B12對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1,稱(chēng)取維生素B12對(duì)照品(批號(hào)100248－2002)約10 mg,用水溶解并定容至100.0 mL,搖勻。

維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量維生素B12對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,用水作為溶劑逐級(jí)稀釋,配制成0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.5,3.0,5.0 mg·L－1的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

維生素B12對(duì)照品溶液:1.0 mg·L－1,稱(chēng)取維生素B12對(duì)照品約10 mg,用水溶解并定容至100.0 mL,搖勻,用0.45μm 濾膜過(guò)濾,取1 mL 濾液置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻。

甲醇為色譜純;磷酸氫二鈉等其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

用于測(cè)定含量的慶大霉素普魯卡因維B12膠囊樣品共47批,分別為A 廠3批、B廠3批、C廠3批、D廠38批;用于評(píng)價(jià)含量均勻度的樣品共6批,分別為A廠1批、B廠1批、C廠1批、D廠3批。

1.2 儀器工作條件

CAPCELL PAK ACR C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫30 ℃;流量1 mL·min－1;進(jìn)樣量100μL;檢測(cè)波長(zhǎng)362 nm。流動(dòng)相:A 為甲醇,B為0.028 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.2)。梯度洗脫程序:0～3 min時(shí),A 為15%;3～15 min時(shí),A 由15%升至28%,保持2 min;17～19 min時(shí),A 由28%降至15%,保持6 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品中維生素B12含量的測(cè)定

取出同廠同批次的20顆慶大霉素普魯卡因維B12膠囊內(nèi)容物并將其混合均勻。稱(chēng)取適量?jī)?nèi)容物(其中維生素B12質(zhì)量約為10μg),加水約5 mL,超聲5 min(控溫25 ℃),用水定容至10.0 mL,搖勻,用0.45μm 濾膜過(guò)濾,濾液即為含量測(cè)定用供試品溶液A。每批樣品制備兩份供試品溶液A,按照儀器工作條件測(cè)定其中維生素B12的含量。

1.3.2 含量均勻度評(píng)價(jià)

取慶大霉素普魯卡因維B12膠囊1 粒,加水約5 mL,超聲5 min(控溫25 ℃),用水定容至10.0 mL,搖勻,用0.45μm 濾膜過(guò)濾,濾液即為含量均勻度測(cè)定用供試品溶液B。每批樣品制備10份供試品溶液B,按照儀器工作條件測(cè)定其中維生素B12的含量,用于含量均勻度評(píng)價(jià)。

1.3.3 陰性樣品溶液的制備

按各企業(yè)處方稱(chēng)取輔料,按供試品溶液A 的制備方法制備陰性樣品溶液,按照儀器工作條件測(cè)定其中維生素B12的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對(duì)維生素B12對(duì)照品溶液、供試品溶液A、陰性樣品溶液進(jìn)行測(cè)定,所得色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品溶液、供試品溶液A 和陰性樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference solution,test solution A and negative sample solution

由圖1可知:供試品溶液A 中維生素B12的保留時(shí)間為14.98 min,與相應(yīng)對(duì)照品溶液的一致,而陰性樣品溶液在相同保留時(shí)間處無(wú)色譜峰,表明輔料對(duì)維生素B12的測(cè)定無(wú)干擾。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動(dòng)相

試驗(yàn)考察了分別以甲醇-水體系、甲醇-磷酸二氫鉀溶液體系、甲醇-0.028 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液體系作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)維生素B12測(cè)定的影響。結(jié)果表明:以甲醇-0.028 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.2)體系進(jìn)行梯度洗脫時(shí),慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12可以和鹽酸普魯卡因有效分離,且維生素B12的保留時(shí)間適宜、峰形較好,能夠滿(mǎn)足分析要求。因此,試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相為甲醇-0.028 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.2)體系。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

利用DAD 的在線(xiàn)掃描功能,在波長(zhǎng)200～800 nm 內(nèi)對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外吸收光譜掃描,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 維生素B12的紫外掃描光譜圖Fig.2 UV scanning spectrum of Vitamin B12

由圖2可知:維生素B12有兩個(gè)吸收峰,分別在362,550 nm 處。在實(shí)際測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn),550 nm 處的基線(xiàn)較362 nm 的平穩(wěn),但此處的吸光度僅為362 nm 處的30%。由于樣品中維生素B12的含量較低,綜合考慮靈敏度和穩(wěn)定性等因素,試驗(yàn)選擇的檢測(cè)波長(zhǎng)為362 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和測(cè)定下限

按照儀器工作條件對(duì)維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以維生素B12的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍為0.2～5.0 mg·L－1,線(xiàn)性回歸方程為y＝98.32x－2.320,相關(guān)系數(shù)為1.000。

以10倍信噪比(S/N)計(jì)算測(cè)定下限(10S/N),所得結(jié)果為0.12 mg·L－1。

2.4 儀器精密度試驗(yàn)

按照儀器工作條件對(duì)維生素B12對(duì)照品溶液分別測(cè)定6次,得到維生素B12峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將供試品溶液A 分別放置0,2,4,8,12,16 h后,在儀器工作條件下測(cè)定,得到維生素B12的峰面積的RSD 為0.60%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取A 廠的慶大霉素普魯卡因維B12膠囊(批號(hào)為17011501),按試驗(yàn)方法制備6份供試品溶液A,分別在儀器工作條件下測(cè)定,得到維生素B12的測(cè)定值為標(biāo)示量的94.4%,測(cè)定值的RSD 為1.5%。

2.7 回收試驗(yàn)

取A 廠批號(hào)為17011501 的樣品9 份,每份約0.1 g,溶解后分別置于10 mL容量瓶中,分為3組,每組3份,每組分別對(duì)應(yīng)加入5.0 mg·L－1維生素B12對(duì)照品溶液3.0,5.0,7.0 mL,按試驗(yàn)方法制備供試品溶液A 并測(cè)定,計(jì)算維生素B12的回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of tests for recovery

由表1可知,維生素B12的回收率為96.9%～102%。

2.8 原輔料相容性試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[15],試驗(yàn)考察了由4個(gè)生產(chǎn)企業(yè)提供的輔料對(duì)測(cè)定的影響。將維生素B12和輔料按質(zhì)量比1∶5的比例進(jìn)行混合,然后按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行原輔料相容性試驗(yàn),同時(shí)與相同質(zhì)量濃度的維生B12對(duì)照品溶液的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。若兩者的峰面積差別明顯,則應(yīng)對(duì)產(chǎn)生這種差異的原因進(jìn)行進(jìn)一步的探究。結(jié)果顯示,兩者維生素B12的峰面積基本無(wú)差別,說(shuō)明所用輔料對(duì)維生素B12的含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

2.9 樣品分析結(jié)果的差異及原因分析

按1.3.1節(jié)方法測(cè)定47批樣品中的維生素B12含量,并參考中國(guó)藥典二部中對(duì)于制劑有效成分含量的計(jì)算方法,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(相對(duì)于標(biāo)示量),所得結(jié)果和結(jié)果分布圖見(jiàn)表2和圖3。/

表2 47批樣品分析結(jié)果Tab.2 Analytical results of 47 batches of samples

圖3 4個(gè)廠家的47批樣品中維生素B12的測(cè)定結(jié)果分布圖Fig.3 Results distribution of Vitamin B12in the 47 batches of samples from 4 manufacturers

中國(guó)藥典二部中對(duì)于主成分含量限度的要求一般為標(biāo)示量90.0%～110.0%,因慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12的標(biāo)示量較低(每粒僅含10μg),故可將此限度放寬至80.0%～120.0%。由表2結(jié)果可知:在所分析的47 批樣品中,來(lái)自A廠、B廠、C廠的9批樣品中的維生素B12的相對(duì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為95.0%～110.0%,均在要求的范圍內(nèi);D 廠的為55.4%～137.0%,超出要求的范圍,異常樣品有9批,其中,有1批樣品的測(cè)定值小于標(biāo)示量的80.0%,有8 批樣品的測(cè)定值大于標(biāo)示量的120.0%,推測(cè)可能和樣品的均勻度有關(guān)。

為了考察相同批次或不同批次樣品的均勻度,按1.3.2節(jié)試驗(yàn)方法將A 廠、B 廠、C 廠各一個(gè)批次和D 廠3個(gè)批次共計(jì)6批樣品制成供試品溶液B,并對(duì)其中維生素B12含量進(jìn)行測(cè)定。每批制備10個(gè)供試品溶液,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(相對(duì)于標(biāo)示量),并計(jì)算了測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)、標(biāo)示量與測(cè)定值之差的絕對(duì)值(A)以及判別結(jié)果(L,L＝A＋2.2s),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 6批樣品含量均勻度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of test for content uniformity of 6 batches of samples

根據(jù)中國(guó)藥典二部中對(duì)于主成分含量的要求及膠囊樣品中維生素B12的標(biāo)示量較低的特點(diǎn),將含量均勻度判別結(jié)果L值的限值定為±25.0%。表3結(jié)果顯示,A 廠、B廠、C 廠的3批樣品的L值均小于20.0%,D 廠的3批樣品的L值均大于25.0%。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn):D 廠的供試品溶液B 的顏色有深有淺,而D 廠所用輔料均為非紅色,而維生素B12原料為深紅色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末,說(shuō)明溶液顏色差異可能與維生素B12含量差異有關(guān);D 廠同一批10個(gè)供試品溶液B 中維生素B12相對(duì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)波動(dòng)較大,在70.0%～300.0%內(nèi)浮動(dòng)。由此可知,是D 廠樣品批次內(nèi)與批次間樣品中的維生素B12含量的不均勻?qū)е铝薉 廠的部分樣品含量的差異。

試驗(yàn)分析了D 廠維生素B12含量不均勻的原因。從原輔料相容性試驗(yàn)結(jié)果可知,原輔料對(duì)維生素B12的含量無(wú)明顯影響。從A 廠、B 廠、C 廠以及D 廠反饋的調(diào)查問(wèn)卷情況及實(shí)地調(diào)研可知:D 廠采用干法混合三種主成分和輔料,而A 廠、B 廠和C廠均先采用水或70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液將維生素B12溶解后,再采用噴灑的方式與其他材料混勻。由此推測(cè),D 廠批內(nèi)和批間樣品中維生素B12含量的不均勻可能與干法混合工藝有關(guān)。因此,建議D 廠開(kāi)展核查工作,確定干法混合工藝是否與維生素B12含量不均勻相關(guān),以便提高產(chǎn)品質(zhì)量。

本工作建立了測(cè)定慶大霉素普魯卡因維B12膠囊中維生素B12含量的高效液相色譜法,并對(duì)不同廠家同一批次或不同批次樣品中的維生素B12含量均勻度進(jìn)行了評(píng)價(jià),并查找了產(chǎn)生含量不均勻的原因。該方法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好,所需的分析時(shí)間與超高效液相色譜法的接近等優(yōu)點(diǎn),可為慶大霉素普魯卡因維B12膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。