韓忠耀,曹 芳,江品良,李 燕,李仕外,唐文雙,余躍生,張林甦

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,都勻 558000)

水冬瓜葉、水冬瓜樹皮、水冬瓜根皮均為民族藥材,來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木的不同部位。其中,水冬瓜樹皮為有齒鞘柄木的干燥根皮[1],別名為大接骨丹樹皮,具有抗炎鎮(zhèn)痛活性[2]。目前研究對象主要集中在水冬瓜根皮上,研究內(nèi)容主要關(guān)于化學(xué)成分分析[3-6]、工藝參數(shù)考察[7]、指紋圖譜建立[8-9]、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[10],及紫丁香苷、總黃酮、浸出物等含量測定[11-13]等。作為民族藥材水冬瓜根皮的潛在替補(bǔ)藥材,水冬瓜樹皮的研究對于野生植物藥資源的保護(hù)、開發(fā)與綜合利用具有重要意義。由于指紋圖譜技術(shù)在植物藥材研究中的應(yīng)用廣泛且具有獨(dú)特優(yōu)勢[14-16],本研究采用高效液相色譜法(HPLC)建立了水冬瓜樹皮的指紋圖譜,基于文獻(xiàn)[9]進(jìn)行了方法學(xué)考察,并結(jié)合相似度分析,主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLSDA)等化學(xué)模式識別法,對不同采收期的水冬瓜樹皮的指紋圖譜進(jìn)行了綜合評價(jià),以期為不同采收期水冬瓜樹皮藥材綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(DAD);FA1004B 型電子天平;Sartorius BT25S型電子天平;101-3AB 型烘箱;HH 系列數(shù)顯恒溫水浴鍋。

對照品溶液:取適量紫丁香苷對照品,用甲醇超聲溶解后,轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中,用甲醇將其稀釋配制成0.164 8 g·L－1對照品溶液。

紫丁香苷對照品,20 mg· 支－1,批 號為 161214;乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器工作條件

Agela Promosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫35 ℃;檢測波長210 nm;進(jìn)樣量5μL;流量1.0 mL·min－1;流動(dòng)相:A 為乙腈,B為0.5%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸溶液。梯度洗脫程序:0～10 min時(shí),B為91.0%;10～20 min時(shí),B由91.0%降至85.6%;20～25 min 時(shí),B 由85.6% 降 至82.0%;25～45 min 時(shí),B 由82.0%降 至78.5%;45～60 min 時(shí),B 由78.5% 降 至30.0%;60～70 min時(shí),B由30.0%升至91.0%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集及篩選

水冬瓜樹皮均采自貴州省黔南布依族苗族自治州都勻市杉木湖溝渠,采集的藥材經(jīng)天津藥物研究院有限公司鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木的樹皮。依據(jù)當(dāng)年有齒鞘柄木野外藥材實(shí)際返青時(shí)間(4～12月)采集樣本,在返青后的前期,每月采集樣本1～3次;在返青后的后期,每月采集樣本1～2次。

構(gòu)建HPLC 指紋圖譜后,與其他批次樣品相比,返青初期(4月初)樣本的相似度較低,故對構(gòu)建HPLC的樹皮樣品進(jìn)行了重新篩選,最終確定樣品采集信息。采集水冬瓜樹皮樣品的編號為S1～S11,生長環(huán)境為山坡、溝渠,黃壤土,伴生植物主要有芭茅、囊吾等;采集經(jīng)度為107°30′52.33″E,緯度為26°15′46.16″N,海拔為807 m;采集時(shí)間分別為2017年 的4 月15 日、5 月10 日、5 月20 日、6 月15日、7月10日、7月20日、8月15日、9月15日、10月15日、11月15日和12月15日。

1.3.2 樣品的測定

將新鮮剝下的水冬瓜樹皮置于55 ℃烘箱中烘干,粉碎后過孔徑為(250±9.9)μm 的四號藥典篩?；靹蚝?稱取0.5 g藥材粉末于100 mL 圓底燒瓶中,加入甲醇50 mL,于90℃回流1 h。放冷后用定性濾紙過濾,濾液收集在50 mL容量瓶中。用甲醇定容,過0.45μm 微孔濾膜,濾液即為供試品溶液,供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 儀器精密度試驗(yàn)

取S1水冬瓜樹皮,按照試驗(yàn)方法對其進(jìn)行測定,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄6次色譜圖中共有色譜峰峰面積和保留時(shí)間。以4號峰紫丁香苷的色譜峰為參比峰,計(jì)算得到的各共有峰對應(yīng)的物質(zhì)與紫丁香苷的相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1.7%,各共有峰與紫丁香苷的相對峰面積的RSD均小于2.3%,說明儀器精密度良好。

2.1.2 方法重復(fù)性試驗(yàn)

取S1水冬瓜樹皮,按照試驗(yàn)方法平行制備供試品溶液6份,按照儀器工作條件測定,記錄色譜圖中共有色譜峰峰面積和保留時(shí)間。以4號峰紫丁香苷的色譜峰為參比峰,計(jì)算得到的各共有峰對應(yīng)的物質(zhì)與紫丁香苷的相對保留時(shí)間的RSD 均小于1.4%,各共有峰與紫丁香苷的相對峰面積的RSD均小于2.3%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.3 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S1水冬瓜樹皮,按照試驗(yàn)方法制備供試品溶液,分別放置0,2,6,12,24,36 h后進(jìn)樣測定,記錄色譜圖中共有色譜峰峰面積和保留時(shí)間。以4號峰紫丁香苷為參比峰,計(jì)算得到的各共有峰與紫丁香苷的相對保留時(shí)間的RSD 均小于1.7%,各共有峰與紫丁香苷的相對峰面積的RSD 均小于2.2%,表明供試品溶液在36 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2 指紋圖譜的建立

按照試驗(yàn)方法制備S1～S11 水冬瓜樹皮的供試品溶液,并按照儀器工作條件進(jìn)樣測定,將AIA格式色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》[國家藥典委員會(GPC)2004 A 版],基于S6色譜圖,以軟件中的方法“中位數(shù)”生成對照指紋圖譜(時(shí)間寬度為0.1 min),得到的11個(gè)批次樣品的HPLC指紋圖譜,紫丁香苷色譜圖、對照指紋圖譜及S1～S11的指紋圖譜見圖1。以共有峰4(對應(yīng)紫丁香苷)為參比峰,計(jì)算18個(gè)共有峰與紫丁香苷的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。結(jié)果顯示,18個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間的RSD 均小于2.5%,而相對峰面積的RSD 在30%～124%內(nèi)波動(dòng),說明不同采收期內(nèi)水冬瓜樹皮的18個(gè)共有峰對應(yīng)的物質(zhì)的含量差異較大。

2.3 相似度評價(jià)

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(國家藥典委員會2004 A 版)中夾角余弦相似度方法計(jì)算各批次試樣的指紋圖譜、對照指紋圖譜之間的相似度[17],結(jié)果見表2。

圖1 紫丁香苷色譜圖、對照指紋圖譜和S1～S11的指紋圖譜Fig.1 Chromatograms of syringin,control fingerprint and fingerprints of S1～S11

表2 對照指紋圖譜及S1～S11試樣的指紋圖譜之間的相似度結(jié)果Tab.2 Results of similarity between control fingerprint and fingerprints of S1－S11

由表2可知:不同采收期水冬瓜樹皮的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.932～0.982,表明不同采收期各批次藥材的一致性相對較好,藥材質(zhì)量整體穩(wěn)定、可控。

2.4 化學(xué)模式差異性評價(jià)

2.4.1 系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

將18個(gè)共有峰的相對峰面積導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 25統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,采用組間均聯(lián)法,以歐式平方距離為分類依據(jù),進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,11個(gè)批次藥材聚類分析結(jié)果見圖2。

由圖2可知:當(dāng)歐式平方距離為25時(shí),可將11批次不同采收期水冬瓜樹皮分為2類,其中除S10外的其他批次聚為第一類,記作第1組,S10單獨(dú)聚為第二類,記作第2組。

2.4.2 PCA 和OPLS-DA 結(jié)果

圖2 S1～S11系統(tǒng)聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of hierarchical cluster analysis for S1～S11

基于文獻(xiàn)[18-20],將18個(gè)共有峰相對峰面積作為變量導(dǎo)入SIMCA-P＋12.0化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件中進(jìn)行自動(dòng)擬合,以主成分1(峰2)為橫坐標(biāo),以主成分2(峰3)為縱坐標(biāo)繪制PCA 得分散點(diǎn)圖,結(jié)果見圖3。

圖3 PCA 得分散點(diǎn)圖Fig.3 Score scatter plot of PCA

由圖3可知:S10偏離中心點(diǎn)最遠(yuǎn),和其他批次存在顯著性差異,這與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果一致。

采用上述方法進(jìn)行OPLS-DA 研究,以主成分1(峰2)為橫坐標(biāo),以主成分2(峰3)為縱坐標(biāo),并根據(jù)圖2系統(tǒng)聚類分析結(jié)果與圖3 PCA 得分散點(diǎn)結(jié)果,將S1～S11分為2組,S10單獨(dú)第2組,其他批次為第1組,繪制第1組與第2組的得分散點(diǎn)圖,結(jié)果見圖4。同時(shí),采用變量投影重要性(VIP)準(zhǔn)則進(jìn)行統(tǒng)計(jì)篩選,以主成分共有峰峰號為橫坐標(biāo),以VIP值為縱坐標(biāo)繪制共有峰VIP圖,結(jié)果見圖4,其中,峰1數(shù)據(jù)在導(dǎo)入SIMCA-P＋12.0化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件時(shí)被自動(dòng)篩除。

由圖4可知:第1組與第2組的得分散點(diǎn)圖結(jié)果和PCA、系統(tǒng)聚類分析結(jié)果一致,說明第1組與第2組區(qū)分效果較好;除峰1和峰4外,16個(gè)共有峰按照VIP值由大到小的順序排序依次為峰16、峰8、峰6、峰5、峰7、峰11、峰2、峰10、峰3、峰18、峰9、峰14、峰12、峰13、峰17、峰15,其中,峰16、峰8、峰6、峰5、峰7、峰11、峰2等7個(gè)共有峰的VIP值大于1.0,峰10、峰3、峰18、峰9、峰14、峰12、峰13、峰17等8個(gè)共有峰VIP 值均大于0.9,峰15 VIP值大于0.8,說明不同批次水冬瓜樹皮藥材的質(zhì)量存在微小差異,峰1～峰18可以用來衡量不同采收期內(nèi)水冬瓜樹皮二次代謝產(chǎn)物動(dòng)態(tài)積累的差異,具有典型的代表性與構(gòu)建的HPLC 指紋圖譜共有峰的科學(xué)性。由于峰16、峰8、峰6、峰5、峰7、峰11、峰2(VIP值大于1.0)對不同采收期水冬瓜樹皮的分類具有顯著性影響,可將其對應(yīng)的物質(zhì)作為不同采收期水冬瓜樹皮中主要化學(xué)成分變化的質(zhì)量差異標(biāo)志物。本工作還嘗試采用液相色譜-質(zhì)譜法鑒別這7種質(zhì)量差異標(biāo)記物的具體化學(xué)成分的歸屬,但由于該藥材基礎(chǔ)研究的缺乏,未能取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展,需要進(jìn)一步深入研究與探討。

圖4 第1組與第2組的得分散點(diǎn)圖、各共有峰VIP值Fig.4 Score scatter plot of group 1 and group 2 and VIP values of common peaks

本工作基于高效液相色譜數(shù)據(jù)建立了水冬瓜樹皮的指紋圖譜,評價(jià)了不同采收期樣品的相似度,采用系統(tǒng)聚類分析將采集的樣本分為2組,采用PCA和OPLS-DA 驗(yàn)證了系統(tǒng)聚類的分析結(jié)果并給出了可以作為反映不同采收期水冬瓜樹皮中主要化學(xué)成分變化的質(zhì)量差異標(biāo)志物。本方法可為水冬瓜樹皮的質(zhì)量控制及后期開發(fā)利用奠定基礎(chǔ),為民族藥材的臨床用藥提供實(shí)際參考。