王曉玲，蔡國(guó)林，李衛(wèi)青，初麗君，徐會(huì)茹，王珊珊，李 秋，杜祖波,*

1. 山東魯花集團(tuán)有限公司 (煙臺(tái) 265200)2. 山東省花生油脂與蛋白精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (煙臺(tái) 265200) 3. 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 (無(wú)錫 214122)

花生粕是花生仁壓榨制油后的副產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)，是我國(guó)蛋白質(zhì)飼料原料市場(chǎng)的重要組成部分，2019年我國(guó)花生粕產(chǎn)量為411.6萬(wàn)t，預(yù)計(jì)2020年有望突破430萬(wàn)t?；ㄉ娠曈脙r(jià)值較高，代謝能居于粕類飼料首位，粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)48%左右，功能特性與大豆蛋白相近，但相較于大豆蛋白更容易吸收，且腸胃脹氣因子也很少[1]，作為幼齡動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的精氨酸，也是所有蛋白質(zhì)飼料原料中含量最高的，可達(dá)5.2%?；ㄉ蛇€含有豐富的黃酮類物質(zhì)，總黃酮含量高達(dá)1.095 mg/g；其礦物質(zhì)含量也比較豐富，含有K、Ca、Mg、Fe、Zn等多種元素。此外，花生粕中油脂類、鞣質(zhì)、酚類、維生素、卵磷脂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量也較為豐富[2]。但花生粕易感染黃曲霉菌，產(chǎn)生的黃曲霉毒素種類較多，其中含量最多、危害最大的是黃曲霉毒素B1[3](AFB1)。AFB1會(huì)對(duì)動(dòng)物的肝臟造成傷害，并對(duì)其生長(zhǎng)性能產(chǎn)生顯著影響[4]。

目前去除黃曲霉毒素的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法、化學(xué)法主要采用吸附法、強(qiáng)氧化劑處理法等，易造成黃曲霉毒素去除不完全、產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)損失等問(wèn)題，限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。生物法處理?xiàng)l件溫和，同時(shí)還能提升花生粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及飼用品質(zhì)，近年來(lái)備受關(guān)注。

本研究旨在通過(guò)篩選獲得能高效降解黃曲霉毒素的菌株，并將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，通過(guò)降解花生粕中的黃曲霉毒素，提高產(chǎn)品的飼用安全性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要原料、試劑

霉變花生粕，購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；乳酸片球菌，江南大學(xué)提供；牛肉膏，蛋白胨，氫氧化鈉及其他常規(guī)試劑，均購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99%)、甲醇、乙腈(HPLC)，購(gòu)自Sigma公司；25 mm、50 mm規(guī)格的0.22 μm微孔濾膜，購(gòu)自上海興亞凈化材料廠。

1.1.2主要儀器、設(shè)備

超凈工作臺(tái)(SW-CJ-IFD)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器(GI54DWS)，致微(廈門(mén))儀器有限公司；PCR基因擴(kuò)增儀(TC-25/H)，杭州博日科技有限公司；凝膠電泳圖像分析儀(JD-801)，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；高效液相色譜儀(U3000)，美國(guó)Dionex公司。

1.1.3培養(yǎng)基制備

(1)分離培養(yǎng)基

肉湯液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

肉湯固體培養(yǎng)基：肉湯液體培養(yǎng)基中加瓊脂2%，121 ℃滅菌20 min。

(2)篩選培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：KH2PO40.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，KNO30.5 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.005 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.003 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌后加入4 μg/mL的AFB1，使其終濃度為20 ng/mL。 復(fù)篩培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基中加入4 μg/mL的AFB1，使其終濃度為20 ng/mL。

(3)其他培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：花生粕50 g，自來(lái)水50 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株的篩選

菌株初篩：稱取50 g含有AFB1花生粕，裝入250 mL的三角瓶中，加入無(wú)菌水使得料液比為1∶1，200 r/min 搖床震蕩20 min，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取少許花生粕溶于無(wú)菌水中，梯度稀釋后涂布在初篩培養(yǎng)基上，挑取平板上全部菌落，甘油管保存。

菌株復(fù)篩：將初篩分離得到的菌株24 h一級(jí)活化，12 h二級(jí)活化。經(jīng)二級(jí)活化后的菌株以10%的接種量接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)48 h。10 000 r/min離心發(fā)酵液并取上清，檢測(cè)AFB1含量，比較不同初篩菌株發(fā)酵前后AFB1降解率，挑選降解率高的菌株做固態(tài)發(fā)酵篩選。

1.2.2菌株固態(tài)發(fā)酵

將經(jīng)過(guò)復(fù)篩的菌株24 h一級(jí)活化，12 h二級(jí)活化，以10%的接種量接種至料液比為1∶1的花生粕中，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵60 h，提取發(fā)酵花生粕中的AFB1，檢測(cè)發(fā)酵前后AFB1的降解率，選取降解率最高的菌株作為目標(biāo)菌株。

1.2.3菌株的鑒定

(1)對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征鑒定

觀察菌落形態(tài)，并根據(jù)表型特征及生理生化特征進(jìn)行分析。

(2)16S rDNA序列分析進(jìn)行菌株鑒定

參照基因組試劑盒(細(xì)菌)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行菌株基因組的提取，使用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)。并將比對(duì)后的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析[5]。

1.2.4AFB1降解菌株在花生粕發(fā)酵酶解偶聯(lián)工藝中的應(yīng)用

花生粕經(jīng)粉碎、滅菌(100 ℃、1 min)后，分別添加0.1%的纖維素酶和木聚糖酶，按5%接種量接種AFB1降解菌和乳酸片球菌，同時(shí)調(diào)節(jié)水分至45%±1%，輸送至發(fā)酵床，發(fā)酵料層高50 cm，配備通氣和加熱裝置，37 ℃好氧發(fā)酵60 h，發(fā)酵完成后輸送至低溫沸騰烘干機(jī)，經(jīng)烘干、粉碎后，打包為成品。發(fā)酵酶解偶聯(lián)工藝具體流程如圖1所示。

圖1 花生粕發(fā)酵酶解偶聯(lián)工藝流程圖

1.2.5AFB1含量的測(cè)定

AFB1含量的測(cè)定：參照《飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定 高效液相色譜法》GB/T 36858—2018執(zhí)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

觀察培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)情況，對(duì)平板上長(zhǎng)勢(shì)較好的12株菌落進(jìn)行編號(hào)，分別為Y-1至Y-12，獲得初篩菌株。

將初篩得到的12株菌株進(jìn)行復(fù)篩，測(cè)定各菌株對(duì)AFB1的降解情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖中可以看出Y-2、Y-6、Y-7、Y-8、Y-12等5株菌株有較好的降解效果，可以作為候選菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同初篩菌株液態(tài)發(fā)酵對(duì)AFB1的降解作用

對(duì)復(fù)篩得到的5株菌株分別進(jìn)行花生粕固態(tài)發(fā)酵。取發(fā)酵后花生粕烘干并粉碎，提取AFB1，測(cè)定各菌株對(duì)花生粕中AFB1的降解情況，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同復(fù)篩菌株固態(tài)發(fā)酵對(duì)AFB1的降解作用

從圖中可以看出Y-6號(hào)菌株對(duì)花生粕的AFB1降解效果最明顯，降解率達(dá)78.6%，明顯高于其他菌株。

2.2 AFB1降解菌株的鑒定

2.2.1菌落及菌種的形態(tài)鑒定

Y-6號(hào)菌株在肉湯固體培養(yǎng)基上的菌落形狀如圖4a所示，菌落表面有褶皺，粗糙不透明，呈微黃色或灰白色。在肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，會(huì)形成皺醭。將Y-6號(hào)菌株進(jìn)行革蘭氏染色后，呈紫色，經(jīng)鏡檢菌體為橢圓形或柱狀，見(jiàn)圖4b；菌體周圍伴有芽孢，見(jiàn)圖4c。從Y-6號(hào)菌株形態(tài)特征可以初步判定其為芽孢桿菌屬，但需要進(jìn)一步的序列分析準(zhǔn)確判定其類型。

圖4 Y-6號(hào)菌株菌落形態(tài)及鏡檢圖片

2.2.2菌種的分子鑒定

將Y-6號(hào)菌株的16S rDNA基因序列在NCBI(http:www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行Blast比對(duì)分析，其基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖5所示。根據(jù)比對(duì)結(jié)果可以看出，Y-6號(hào)菌株與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性最高，達(dá)到99%，一般認(rèn)為同源性大于98%就可以認(rèn)為屬于同一個(gè)種[6]。

圖5 Y-6號(hào)菌株基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

綜上所述，根據(jù)形態(tài)特征并結(jié)合16S rDNA基因序列比對(duì)，確定該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis Y-6。

2.3 發(fā)酵酶解偶聯(lián)工藝對(duì)AFB1含量的影響

通過(guò)添加Bacillus subtilis Y-6，利用微生物發(fā)酵結(jié)合復(fù)合酶制劑的生物偶聯(lián)工藝處理花生粕，研究處理前后花生粕中AFB1含量的變化，如圖6所示。

圖6 處理前后花生粕中AFB1含量的變化

由圖6可以看出，處理前后花生粕中AFB1含量變化明顯。經(jīng)計(jì)算，處理前其含量為142.6 μg/kg，處理后僅為8.1μg/kg，AFB1的去除率達(dá)到94.3%。直接經(jīng)過(guò)固態(tài)發(fā)酵后花生粕中AFB1的降解率為78.6%，而經(jīng)過(guò)偶聯(lián)工藝后，花生粕中AFB1的降解率達(dá)到了94.3%，這是因?yàn)槿樗崞蚓鷮?duì)AFB1有一定的吸附能力，進(jìn)一步降低了AFB1的含量。國(guó)家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 13078—2001)規(guī)定花生粕中AFB1最高限量50 μg/kg，經(jīng)過(guò)本方法處理后的花生粕AFB1含量?jī)H為8.1 μg/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)家50 μg/kg的限量要求，大大提高了花生粕在畜牧業(yè)的應(yīng)用范圍。

3 結(jié)論

本研究從污染AFB1嚴(yán)重的花生粕中篩選出一株能夠高效降解AFB1的菌株，根據(jù)形態(tài)特征、16S rDNA序列比對(duì)鑒定目的菌株，確定其為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis Y-6。通過(guò)添加篩選出的枯草芽孢桿菌，利用微生物發(fā)酵結(jié)合復(fù)合酶制劑的生物偶聯(lián)工藝處理花生粕，比較處理前后花生粕中AFB1含量的變化。研究表明，處理前AFB1含量為142.6 μg/kg，處理后僅為8.1 μg/kg，AFB1的去除率達(dá)到94.3%，遠(yuǎn)低于國(guó)家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)50 μg/kg的限量要求，大大提升了花生粕的飼用安全性。在生物發(fā)酵去除毒素的基礎(chǔ)上，與生物偶聯(lián)工藝結(jié)合，大大提升了花生粕的品質(zhì)，不僅實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的體外預(yù)消化，而且增加了產(chǎn)品中有機(jī)酸、細(xì)菌素及各種酶類物質(zhì)，增強(qiáng)了產(chǎn)品的功能性。本工藝發(fā)酵后可使花生粕每噸增值約1 000元，除去原輔料、能耗、人工等成本，每噸新增利潤(rùn)300元左右。但由于本研究所用AFB1降解菌為枯草芽孢桿菌，花生粕發(fā)酵后氣味欠佳導(dǎo)致適口性較差，為加快本研究在工業(yè)化生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用，下一步將深入研究改善發(fā)酵風(fēng)味的工藝技術(shù)。