常 盼,李 靜,張 靜,陳偉國(guó),王西輝#,于 軍*

(1西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,西安 710038;2陜西省心血管內(nèi)科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究分中心;*通訊作者,E-mail:pclamper@163.com;#共同通訊作者,E-mail:xixiwang63@126.com)

近年來(lái),糖尿病發(fā)病率急劇增高,成為僅次于心腦血管疾病和癌癥的又一大疾病,嚴(yán)重危害人類健康[1]。糖尿病引起的心肌特異性病變是導(dǎo)致糖尿病病人致殘和致死率增高的主要原因[2],由糖尿病引起的心肌特異性疾病,在沒有發(fā)生其他血管病變的情況下,稱為糖尿病性心肌病,由于糖尿病性心肌病的病理生理學(xué)尚未完全了解,可能涉及多種機(jī)制,包括氧化應(yīng)激、炎癥、心肌纖維化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡性細(xì)胞死亡等,這些也被認(rèn)為是糖尿病性心肌病發(fā)病機(jī)制的潛在促成因素[3,4]。目前糖尿病性心肌病并沒有有效的治療策略,我們前期研究表明,抑制氧化應(yīng)激和凋亡可能是保護(hù)大鼠糖尿病心肌損傷的主要機(jī)制[5]。而氧化應(yīng)激和凋亡的發(fā)生往往與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。有報(bào)道稱,有氧運(yùn)動(dòng)可提高心肌胰島素敏感性,對(duì)肥胖人群和糖尿病患者的心臟功能具有重要的改善作用,是預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的重要且有效的非藥物干預(yù)措施[6]。然而,目前有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病心肌損傷的保護(hù)機(jī)制仍不是很清楚,本研究主要探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠糖尿病心肌損傷的心臟保護(hù)作用,以及其對(duì)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響,并探討相關(guān)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑

鏈脲菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;心肌肌鈣蛋白I(cTnI)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自威海紐普生物技術(shù)有限公司;肌酸激酶(CK-MB)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司;GRP78、CHOP、PKG及β-actin購(gòu)自美國(guó)CST公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;環(huán)鳥苷酸(cGMP)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

8周齡C57BL/6J雄性小鼠40只購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)于西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,室內(nèi)溫度23-25 ℃,相對(duì)濕度40%-60%,自由飲水和攝食。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con),糖尿病心肌損傷組(DCM)和糖尿病心肌損傷+游泳運(yùn)動(dòng)組(DCM+E)。糖尿病心肌損傷組和糖尿病+游泳運(yùn)動(dòng)組小鼠腹腔注射50 mg/kg STZ溶液(注射前用pH為4.5的0.1 mol/L的檸檬酸鈉緩沖液避光配制,現(xiàn)配現(xiàn)用),連續(xù)注射5 d,注射完1周后進(jìn)行小鼠血糖檢測(cè),以空腹血糖大于16.7 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn),且伴有“三多一少”癥狀,視為糖尿病小鼠模型構(gòu)建成功。繼續(xù)喂養(yǎng)12周后誘導(dǎo)糖尿病心肌損傷模型[7]。糖尿病+游泳運(yùn)動(dòng)組,糖尿病小鼠造模成功4周后,給予8周的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

1.3 有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練

有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練采取游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,先進(jìn)行1周的適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后進(jìn)行8周的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,運(yùn)動(dòng)方案為每天游泳60 min,運(yùn)動(dòng)組的動(dòng)物在32-35 ℃的水中進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng),5 d/周,持續(xù)8周。小鼠在第1天游泳15 min,游泳時(shí)間逐漸增加,在1周內(nèi)累積至60 min/d。所有運(yùn)動(dòng)時(shí)間均在上午8點(diǎn)到11點(diǎn)之間進(jìn)行,此過程參考已經(jīng)發(fā)表的有關(guān)文獻(xiàn)[8,9]。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心臟功能

使用連續(xù)超聲Vevo 2100系統(tǒng)采用非侵入性的方法檢測(cè)小鼠心功能。用3%異氟烷麻醉小鼠,脫毛膏去除小鼠胸前毛發(fā)后,利用1%異氟烷維持小鼠麻醉狀態(tài),通過調(diào)整探頭方向,使可清晰顯示出小鼠心臟的心尖部位、三腔部位、四腔部位、五腔切面及左室長(zhǎng)軸等切面。通過手持操縱超聲換能器獲得2D和2D引導(dǎo)M模式的超聲心動(dòng)圖,測(cè)量左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。所有超聲心動(dòng)圖像均使用Vevo 2100分析軟件進(jìn)行分析。

1.5 血漿cTnI及CK-MB的檢測(cè)

收集各組小鼠血漿,根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,采用全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀檢測(cè)血漿中cTnI和CK-MB的含量。

1.6 心肌組織中氧化應(yīng)激MDA、SOD及GSH的檢測(cè)

取各組小鼠左室相同部位心肌組織,提取蛋白,根據(jù)南京建成生物公司提供的ELISA試劑盒說(shuō)明書,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組心肌組織MDA、SOD及GSH的含量。

1.7 心肌組織cGMP的含量檢測(cè)

稱取各組小鼠相同部位的心肌組織塊,進(jìn)行蛋白裂解,根據(jù)生工生物工程有限公司的ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組心肌組織中cGMP的含量。

1.8 Western blot檢測(cè)目的蛋白含量

動(dòng)物處理完后,提取組織蛋白,通過BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品,采用恒流250 mA,120 min的條件將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶常溫封閉2 h,一抗GRP78、CHOP、PKG及β-actin(1 ∶1 000)在4 ℃孵育過夜。二抗1 ∶3 000室溫孵育2 h,ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)免疫印跡。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠糖尿病心肌損傷的影響

首先采用小動(dòng)物超聲檢測(cè)左心功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Con組相比,DCM小鼠心臟功能顯著降低(P<0.01);與DCM組相比,DCM+E組的小鼠心臟功能增加(P<0.01,見圖1)。通過檢測(cè)心肌損傷的標(biāo)志物cTnI及CK-MB,結(jié)果顯示,與Con組小鼠相比,糖尿病小鼠血漿cTnI及CK-MB含量顯著增加(P<0.01);與DCM組相比,DCM+E組心肌組織的cTnI含量及CK-MB含量顯著降低(P<0.01,見圖1)。

與Con組相比,**P<0.01;與DCM組相比,##P<0.01圖1 各組心肌損傷的比較Figure 1 Comparison of myocardial damage between three groups

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠糖尿病心肌組織氧化應(yīng)激的影響

與Con組相比,DCM小鼠心肌組織的MDA和GSH含量顯著增加(P<0.01);與DCM組相比,DCM+E組小鼠心肌組織中MDA和GSH含量降低(P<0.05,,見圖2)。與Con組相比,DCM小鼠心肌組織中SOD含量顯著降低(P<0.01);與DCM組相比,DCM+E組小鼠心肌組織中SOD含量增加(P<0.05,見圖2)。

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的影響

與Con組相比,DCM小鼠心肌組織中GRP78和CHOP的表達(dá)含量顯著增加(P<0.01);與DCM組相比,DCM+E組小鼠心肌組織中GRP78和CHOP的表達(dá)含量顯著降低(P<0.01,見圖3)。

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠糖尿病心肌損傷cGMP-PKG信號(hào)通路的影響

為了探究游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠糖尿病心肌損傷作用的機(jī)制,分別檢測(cè)心肌組織cGMP含量以及蛋白PKG的水平,結(jié)果見圖4。與Con組相比,DCM小鼠心肌組織中cGMP含量及PKG的蛋白水平顯著降低(P<0.01);與DCM組相比,DCM+E組小鼠的心肌組織cGMP水平及PKG的蛋白水平增加(P<0.05)。

與Con組相比,**P<0.01;與DCM模型組相比,#P<0.05圖2 各組心肌氧化應(yīng)激的比較Figure 2 Comparison of myocardial oxidative stress between three groups

與Con組相比,**P<0.01;與DCM模型組相比,##P<0.01圖3 各組心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的比較Figure 3 Comparison of myocardial endoplasmic reticulum stress between three groups

與Con組相比,**P<0.01;與DCM模型組相比,#P<0.05圖4 各組心肌組織中cGMP和PKG的含量比較Figure 4 Comparison of the contents of myocardial cGMP and PKG between three groups

3 討論

糖尿病心肌損傷作為糖尿病的重要并發(fā)癥,最終可導(dǎo)致患者心力衰竭和死亡,嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量,增加社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病心肌損傷發(fā)病緩慢,早期即可出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的異常,左心室肥大、心肌纖維化、舒張功能障礙等[10]。在本研究中,采用小動(dòng)物超聲檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)心臟功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠心臟功能受損,而有氧運(yùn)動(dòng)緩解糖尿病小鼠心臟功能受損,為了探究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病小鼠的心臟保護(hù)效應(yīng),分別檢測(cè)血漿中cTnI以及CK-MB的含量,結(jié)果顯示,有氧運(yùn)動(dòng)降低糖尿病心肌損傷小鼠血漿中cTnI以及CK-MB的含量。以上結(jié)果提示,有氧運(yùn)動(dòng)能緩解糖尿病心肌損傷小鼠的心肌損傷,對(duì)糖尿病心肌損傷小鼠具有心臟保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激通過產(chǎn)生過氧化反應(yīng),從而對(duì)組織產(chǎn)生損傷。由于心肌作為代謝活性很高的組織,其抗氧化能力低于其他組織,所以容易受到過氧化物、超氧化物等自由基的損傷。高糖可升高氧化應(yīng)激,下調(diào)抗氧化能力[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道,跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善糖尿病大鼠心肌損傷的重要機(jī)制可能是通過抑制氧化應(yīng)激NADPH氧化酶表達(dá)和活性實(shí)現(xiàn)的[12]。耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高2型糖尿病大鼠NO活性[13],3周低脂飲食聯(lián)合有氧訓(xùn)練提高心肌細(xì)胞數(shù)量,減少心肌細(xì)胞脂質(zhì)的積累,同時(shí)伴有NO活性的增加,主要是由于SOD參與調(diào)節(jié)NO與過氧亞硝酸鹽的平衡[14]。在本次研究中,通過檢測(cè)氧化應(yīng)激MDA、SOD及GSH的相關(guān)指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)抑制糖尿病心肌損傷小鼠心肌組織MDA和GSH的活性,提高SOD的活性。以上結(jié)果進(jìn)一步表明,有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病心肌損傷具有重要的保護(hù)作用,抑制氧化應(yīng)激可能是防治糖尿病心肌損傷的主要策略之一。

不斷增加的氧化應(yīng)激會(huì)進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的主要細(xì)胞器之一,在參與蛋白質(zhì)合成、折疊、成熟,脂質(zhì)合成及Ca2+穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[16]。持續(xù)的高糖導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡,引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,越來(lái)越多的研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生與糖尿病心肌損傷密切相關(guān)[17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要有3種跨膜蛋白,分別是需肌醇酶1(IRE-1)、蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6),這3種跨膜蛋白在正常情況下與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)結(jié)合處于非活化的連接狀態(tài),當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí),GRP78與3種跨膜蛋白IRE-1、PERK和ATF6解離,激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路[18,19]。本次研究中,檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78的表達(dá),結(jié)果顯示,糖尿病心肌損傷小鼠心肌組織GRP78的含量顯著增加,而有氧運(yùn)動(dòng)可抑制GRP78的表達(dá)。有報(bào)道顯示,抑制GRP78的mRNA轉(zhuǎn)錄水平可保護(hù)糖尿病大鼠心肌損傷[20]。CHOP是凋亡途徑的下游蛋白,其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用,持續(xù)增加的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[21]。通過檢測(cè)糖尿病心肌損傷小鼠心肌組織CHOP的表達(dá)情況,結(jié)果顯示有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可緩解CHOP的增加。以上結(jié)果提示,糖尿病心肌損傷小鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡也顯著增加,而有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是糖尿病心肌損傷的主要病理生理機(jī)制。

第二信使介導(dǎo)的信號(hào)通路,嚴(yán)重影響糖尿病心肌損傷的正常生理功能[22]。為了進(jìn)一步探究有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)糖尿病心肌損傷的保護(hù)機(jī)制,本次研究檢測(cè)第二信使介導(dǎo)的cGMP-PKG信號(hào)通路。課題組前期研究[23]發(fā)現(xiàn),在高糖/高脂的心肌細(xì)胞中,通過給予外源性的鈉尿肽,可激活cGMP-PKG信號(hào)通路,進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。有研究顯示,心血管合并癥不斷加劇導(dǎo)致全身性炎癥增加,氧化應(yīng)激增強(qiáng),最終導(dǎo)致cGMP通過多種途徑降解,從而降低了PKG的活性[24]。但是cGMP-PKG在糖尿病心肌損傷中的作用仍未見報(bào)道,在本次研究中,糖尿病心肌損傷的心肌組織cGMP的活性及PKG的蛋白表達(dá)顯著降低,而有氧運(yùn)動(dòng)處理后心肌組織cGMP的活性及PKG的蛋白表達(dá)明顯增加。提示,糖尿病心肌損傷中cGMP-PKG信號(hào)通路受阻,而有氧運(yùn)動(dòng)處理可激活cGMP-PKG信號(hào)通路,有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制與cGMP-PKG信號(hào)通路的激活有關(guān)。大量的臨床前證據(jù)支持cGMP-PKG通路作為生存信號(hào)的關(guān)鍵作用,并證明其在心肌缺血再灌損傷時(shí),作為最有希望的治療靶點(diǎn)[25,26],尤其是通過鈉尿肽刺激cGMP-PKG信號(hào)通路的活化,已經(jīng)轉(zhuǎn)化為急性冠心病患者的臨床應(yīng)用[27]。以上表明,cGMP-PKG途徑在調(diào)節(jié)心血管方面的重要性得到越來(lái)越多的證據(jù)支持,表明該途徑可能是有前途的治療靶標(biāo)。

綜上所述,糖尿病心肌損傷時(shí),心肌氧化應(yīng)激增加、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)和cGMP-PKG信號(hào)通路受阻,8周的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練)可降低心肌氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,激活cGMP-PKG信號(hào)通路,發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供了有氧運(yùn)動(dòng)改善糖尿病心肌損傷的新思路,為糖尿病心肌損傷的生理病理機(jī)制提供新思路,為其防治提供新的策略。