趙海玉，譚振林，何利偉，朱世杰，顏如玉，寇宏強(qiáng)，彭 健

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州510515

房性快速性心律失常是一組臨床上常見的快速性心律失常，包括心房顫動、心房撲動、房性心動過速，藥物治療效果不滿意，并發(fā)癥嚴(yán)重。近年來經(jīng)導(dǎo)管射頻消融（RF）已成為房性快速性心律失常治療的有效手段之一，原理是通過電極釋放能量產(chǎn)生高溫引起組織的熱損傷，阻斷異常電位的傳導(dǎo)。術(shù)后復(fù)發(fā)是目前房性快速性心律失常特別是心房顫動治療中存在的主要問題。房顫導(dǎo)管消融的基石是肺靜脈電隔離（PVI）［1-2］，研究表明房顫消融術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因是肺靜脈和心房之間電傳導(dǎo)的恢復(fù)［3-4］，這歸咎于消融點(diǎn)未實(shí)現(xiàn)連續(xù)透壁損傷［5］，組織學(xué)研究表明不完全的PVI消融區(qū)的心肌損傷程度與房顫術(shù)后復(fù)發(fā)率有負(fù)相關(guān)性［6］。連續(xù)線性消融對提高房性快速性心律失常的治療成功率尤為重要［7-8］。目前提高RF效率的研究主要著眼于物理材料及技術(shù)的更新，而RF的操作是通過點(diǎn)與點(diǎn)連接形成消融線，點(diǎn)與點(diǎn)之間的組織因未接受足夠的熱量易造成亞致死性損傷，導(dǎo)致留有消融“間隙”或后期傳導(dǎo)恢復(fù)［9］，僅通過物理方法做到電位被完全隔離阻斷仍存在困難。

胺碘酮是一種常用的Ⅲ類抗心律失常藥，在臨床上常被用于控制節(jié)律，在射頻消融圍手術(shù)期作為輔助用藥可預(yù)防和治療房顫［10］，有研究表明術(shù)前應(yīng)用胺碘酮可減少RF完成PVI的消融點(diǎn)數(shù)［11］。本團(tuán)隊(duì)前期一項(xiàng)前瞻性臨床研究表明，射頻消融術(shù)中經(jīng)導(dǎo)管灌注胺碘酮溶液可有效提高術(shù)中肺靜脈電隔離效率和竇律轉(zhuǎn)復(fù)率，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率［12］。

既往文獻(xiàn)報(bào)道，RF造成的組織熱損傷主要為高熱造成的壞死以及凋亡和炎癥［13］。然而，胺碘酮在RF中對心房肌細(xì)胞損傷的影響尚無研究報(bào)道。研究胺碘酮對受熱損傷后的心房肌細(xì)胞的作用對探明其是否能促進(jìn)消融病變從而提高房性心律失常的消融效率具有重要意義。本研究擬建立不完全射頻消融的細(xì)胞模型，胺碘酮加以干預(yù)，初步探索熱處理對心房肌細(xì)胞的損傷作用，及胺碘酮對心房肌細(xì)胞熱損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

小鼠HL1心房肌細(xì)胞（永諾生物）；HWS-20恒溫水浴箱（江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），鹽酸胺碘酮（Amiodarone）注射液（賽諾菲）；細(xì)胞活性檢測試劑盒（MTS）G3580、超氧化物歧化酶（SOD）S0101試劑盒、丙二醛（MDA）S0131試劑盒（碧云天）；小鼠白介素1β（IL-1β）ELISAKit、小鼠白介素6（IL-6）ELISAKit、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISAKit（武漢華美生物）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HL-1心房肌細(xì)胞在含10%胎牛的Dulbecco改良版Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基含10%血清（FBS，Gibco）和1%青霉素-鏈霉素（Invitrogen），置于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 熱處理 參考Yoshida等［14］的肝臟射頻消融體外模型方法，水浴熱誘導(dǎo)小鼠HL1心房肌細(xì)胞，體外模擬射頻消融術(shù)中亞致死的心房肌細(xì)胞。當(dāng)HL1小鼠心房肌細(xì)胞生長至80%匯合時，通過胰蛋白酶消化，洗滌并在1.5 mL微量離心管中用1 mL含10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞（5×104）并立即在溫度37、46、49、52、55、58 ℃的恒溫水浴箱中培養(yǎng)10 min，然后將細(xì)胞接種到含10%FBS的100 μLDMEM中的96孔培養(yǎng)板中（1×104/孔），繼續(xù)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，MTS法測量吸光度顯示存活率，得出對比于37 ℃細(xì)胞活力降低25%的溫度，數(shù)據(jù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 藥物干預(yù) 先用鹽酸胺碘酮注射液與DMSO配成100 mmol/L的母液，HL-1心房肌細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞匯合度到80%時，分別加入不同劑量的胺碘酮母液滴定至濃度為0、3、10、30、60、90 μmol/L，在37 ℃恒溫水浴箱中持續(xù)1 h，繼續(xù)在37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)12 h，用MTS法測量吸光度，得出對比于無藥物（0 μmol/L）時細(xì)胞活力降低25%的藥物濃度，此濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 HL1心房肌細(xì)胞按前述1.2.1的方法培養(yǎng)并接種至96孔培養(yǎng)板（1×104/孔）后按下列方式分組：空白對照組：置于37 ℃恒溫水浴箱；熱處理組：置于1.2.2選出的溫度水浴箱；胺碘酮組：滴定至實(shí)驗(yàn)1.2.3所選的胺碘酮濃度再立即置于1.2.2選出的溫度水浴箱，3組細(xì)胞均置于相應(yīng)水浴箱10 min后繼續(xù)在37 ℃、5%CO2下復(fù)溫培養(yǎng)12 h進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測定。

1.2.5 MTS檢測細(xì)胞活性 3個實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，加入5 mg/mL 的MTS 溶液（20 μL/孔），室溫孵育4 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO（150 μL/孔），放入振蕩儀勻速振蕩15 min，采用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔的吸光度A490nm，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞密度至2×106/mL，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃，1000 r/min離心10 min，棄上清，加入預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，相同條件下離心10 min，PBS 洗滌，加入200 μL Binding Buffer，分別加入5 μLAnnexin V-FITC與PI充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入300 μL Binding Buffer，置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA試劑盒測定炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.8 檢測MDA與SOD活性 采用不含血清的培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA（稀釋比1∶1000），DCFH-DA 終濃度為10 μmol/L，將DCFH-DA分別加入“1.2.4”實(shí)驗(yàn)分組的細(xì)胞中，室溫避光孵育20 min，采用0.25%胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，使用超聲波裂解細(xì)胞，4 ℃，4000 r/min離心15 min，吸取上清液，按照MDA和SOD的ELISA試劑盒檢測活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。首先對組間各樣本量參數(shù)行正態(tài)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，因本研究樣本量較少，均經(jīng)Mann-Whitney U檢驗(yàn)校驗(yàn)結(jié)果相符；所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度梯度下的細(xì)胞活性

以對照組（37 ℃）的細(xì)胞存活率為參照，心房肌細(xì)胞存活率在46 ℃溫度干預(yù)后下降[（89.28±3.11）%vs（100.00±4.75）%，P＜0.01]，且隨溫度的升高，HL1細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低，52 ℃的細(xì)胞存活率為（75.43±1.38）%，該溫度下細(xì)胞失活率約為25%，與對照組的細(xì)胞存活率差異及顯著（P＜0.001，圖1），而55 ℃與52 ℃下心房肌細(xì)胞的存活率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.223），故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用52 ℃作為加熱溫度。

2.2 不同胺碘酮濃度下的細(xì)胞活性

MTS法檢測37 ℃下不同胺碘酮濃度時的細(xì)胞活性，與對照組（0 μmol/L）比較，3 μmol/L的干預(yù)對HL1細(xì)胞存活率并無明顯影響（P=0.507），心房肌細(xì)胞存活率在10 μmol/L濃度的胺碘酮干預(yù)后顯著降低[（100.00±0.65）%vs（94.42±0.69）%，P＜0.001]；30 μmol/L的胺碘酮濃度引起心房肌細(xì)胞存活率明顯下降，存活率為（75.70±1.99）%，失活率約25%，后續(xù)60、90 μmol/L濃度下的存活率與30 μmol/L 差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.126，0.789，圖2），后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用30 μmol/L作為藥物干預(yù)濃度。

2.3 胺碘酮可進(jìn)一步降低加熱導(dǎo)致的小鼠HL1心房肌細(xì)胞存活率

與對照組相比，52 ℃熱處理組的HL1心房肌細(xì)胞活性顯著降低[（75.74±3.28）%vs（99.67±3.26）%，P＜0.001]；加熱同時加30 μmol/L的胺碘酮導(dǎo)致細(xì)胞活性進(jìn)一步降低至（64.15±0.71）%（P＜0.01，圖3）。

圖3 3組細(xì)胞的細(xì)胞存活率Fig.3 Cell viability in different groups. ***P＜0.001 vs the blank group,##P＜0.01 vs heat group(Mean±SD,n=3).

2.4 胺碘酮促進(jìn)熱處理導(dǎo)致的小鼠HL1心房肌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，相比空白組，熱處理組小鼠HL1 心房肌細(xì)胞凋亡率顯著升高[（3.80±0.80）% vs（27.66±0.96）%，P＜0.001]，與熱處理組相比，胺碘酮組小鼠HL1 心房肌細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加至（29.79±0.32）%（P＜0.05，圖4）。

2.5 胺碘酮促進(jìn)熱處理后小鼠HL1心房肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)

ELISA檢測結(jié)果顯示，加熱組心房肌細(xì)胞的IL-1β水平升高（P＜0.01），IL-6 水平顯著升高（P＜0.001），TNF-α數(shù)值有所升高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.383），而聯(lián)合胺碘酮處理后，IL-1β和IL-6 水平進(jìn)一步增加（P＜0.01），TNF-α水平的增加顯著（P＜0.001，表1）。

2.6 胺碘酮對加熱后小鼠HL1心房肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

分光光度計(jì)檢測細(xì)胞MDA、SOD結(jié)果顯示，和空白對照組相比，加熱及加熱聯(lián)合胺碘酮導(dǎo)致MDA表達(dá)升高（P＜0.01），胺碘酮導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激因子MDA進(jìn)一步升高（P＜0.01），加熱導(dǎo)致SOD 活性降低（P＜0.001），胺碘酮的應(yīng)用則導(dǎo)致SOD活性進(jìn)一步降低（P＜0.05，表2）。

3 討論

表1 胺碘酮對熱處理誘導(dǎo)的小鼠HL1心房肌細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影響Tab.1 Effect of amiodarone on heat-induced IL-1β,IL-6 and TNF-α expression in mouse HL1 atrial myocytes(pg/mL,Mean±SD,n=3)

表2 胺碘酮對熱處理誘導(dǎo)的小鼠HL1心房肌細(xì)胞MDA和SOD產(chǎn)生的影響Tab.2 Effect of Amiodarone on heat-induced MDA and SOD production in mouse HL1 atrial myocyte(Mean±SD,n=3)

目前鮮有研究報(bào)道射頻消融對心房肌細(xì)胞的損傷影響，RF的治療原理是射頻電流的熱損傷，參考腫瘤細(xì)胞RF體外研究模型，用恒溫水浴箱加熱心房肌細(xì)胞建立RF細(xì)胞體外熱損傷研究模型［15］，以37 ℃下的細(xì)胞存活率為參照，46 ℃，49 ℃，52 ℃，55 ℃，58 ℃等不同溫度梯度加熱均引起不同程度的小鼠心房肌細(xì)胞存活率下降，提示加熱模型構(gòu)建成功。設(shè)52 ℃為加熱溫度作為熱處理組，小鼠HL1心房肌細(xì)胞的凋亡率、炎癥介質(zhì)IL1β和IL6以及丙二醛釋放均增加，細(xì)胞存活率及SOD活性下降，該結(jié)果提示，熱損傷效應(yīng)可造成心房肌細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激。符合既往研究中RF及熱處理對組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷的研究結(jié)果［16-17］。

快速性心律失常射頻消融治療中導(dǎo)管大頭材料的更新允許我們在RF術(shù)中可經(jīng)導(dǎo)管灌注不同藥物，目前常規(guī)用冷鹽水灌注冷卻導(dǎo)管減少阻抗上升從而造成有效消融［18］，本團(tuán)隊(duì)前期臨床研究表明經(jīng)導(dǎo)管灌注胺碘酮溶液可有效提高RF效率，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率［12］。胺碘酮因廣譜抗心律失常作用被廣泛應(yīng)用于臨床，其不良反應(yīng)也逐漸被報(bào)道：最嚴(yán)重的副作用是肺毒性［19-20］，也可引起肝毒性［21］、甲狀腺毒性［22］、視神經(jīng)毒性［23］等，靜脈注射時可引起靜脈炎［24］。研究表明胺碘酮可促進(jìn)大鼠腎組織MDA和IL-6顯著增加［25］；可引起大鼠肺組織MDA的增加和SOD的減少［26］；胺碘酮能提高人肺上皮細(xì)胞的Bax和Caspase 3的表達(dá)誘導(dǎo)凋亡［27］；可劑量依賴性地增加視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活性氧ROS 的產(chǎn)生，引發(fā)脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞凋亡［28］，還可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞和肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬［29-30］。這些研究表明胺碘酮可能通過凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激促進(jìn)組織細(xì)胞的損傷，胺碘酮作為抗心律失常藥應(yīng)用于射頻消融圍手術(shù)期符合臨床規(guī)范，本團(tuán)隊(duì)前期創(chuàng)新性使用胺碘酮灌注于房顫射頻消融病灶處，發(fā)現(xiàn)可提高術(shù)中轉(zhuǎn)竇率，減少術(shù)后復(fù)發(fā)［12］，基于這一發(fā)現(xiàn)，結(jié)合胺碘酮對組織細(xì)胞的毒性作用，我們推斷其原因可能為胺碘酮在RF術(shù)中的灌注應(yīng)用導(dǎo)致消融點(diǎn)之間的心房肌組織損傷加重從而達(dá)到更有效的肺靜脈隔離，本研究用動物心房肌細(xì)胞加熱加藥模型模擬RF聯(lián)合應(yīng)用胺碘酮探索損傷變化，預(yù)實(shí)驗(yàn)用0、3、10、30、60、90 μmol/L等不同濃度的胺碘酮干預(yù)后測定細(xì)胞存活率變化，發(fā)現(xiàn)6個濃度梯度下的胺碘酮溶液均可降低心肌細(xì)胞存活率，最終選用降低25%細(xì)胞存活率的30 μmol/L胺碘酮濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件，加入胺碘酮溶液后的心房肌細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降，SOD活性進(jìn)一步下降，凋亡率進(jìn)一步增加，炎癥因子、丙二醛進(jìn)一步增加，說明胺碘酮促進(jìn)了熱損傷引起的小鼠心房肌細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激的發(fā)生。此結(jié)果亦符合前述胺碘酮促進(jìn)組織細(xì)胞損傷增加的既往研究。

本實(shí)驗(yàn)的加熱條件52 ℃未造成細(xì)胞全數(shù)死亡，僅造成約25%的細(xì)胞活性下降，模擬了臨床上射頻消融治療時消融點(diǎn)之間不完全損傷的受熱環(huán)境，本研究中將胺碘酮加入水浴加熱的心房肌細(xì)胞模擬了臨床上心房射頻消融術(shù)中經(jīng)大頭導(dǎo)管灌注胺碘酮的應(yīng)用。胺碘酮促進(jìn)加熱后小鼠HL1心房肌細(xì)胞的凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。此為本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)?？赡転榘返馔岣叻啃钥焖傩孕穆墒СＩ漕l消融手術(shù)效率提供了細(xì)胞層面的依據(jù)，也引發(fā)了射頻消融可聯(lián)合灌注不同藥物從而改善手術(shù)效率的思考與探索。

綜上所述，本研究揭示了熱處理可誘導(dǎo)小鼠HL1心房肌細(xì)胞的凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激的表達(dá)，胺碘酮可通過促進(jìn)凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激從而加重?zé)崽幚碓斐傻募?xì)胞損傷。我們首次揭示胺碘酮對熱處理的心房肌細(xì)胞有促損傷作用，但促進(jìn)細(xì)胞損傷的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。盡管本研究采用體外水浴加熱的方法較好地模擬了熱消融術(shù)中消融點(diǎn)之間的亞致死性高熱區(qū)損傷，但是，研究對象小鼠HL1心房肌細(xì)胞卻脫離了體內(nèi)環(huán)境。在細(xì)胞水平上探索得到的作用效果與動物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)踐尚存在一定差距。因此，胺碘酮對射頻消融心房肌組織的影響及其作用機(jī)制仍需結(jié)合臨床及動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。