楊馥霞，湯 玲，賀 歡，孔 芬，王衛(wèi)成，程萬莉

（1 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，蘭州 730070）

（2 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究所）

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是一種研究和探測光合生理的植物活體診斷技術(shù)，是研究無損葉片光合機構(gòu)逆境損傷的有效工具，它的變化能反映出幾乎所有的光合作用的變化[1]。利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是深入了解逆境條件下植物光化學(xué)過程及葉片功能變化的理想手段，廣泛用于逆境脅迫的研究中[2-3]。有關(guān)低溫脅迫研究表明，溫度降至3 ℃，溫州蜜柑葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fo上升，F(xiàn)v/Fm下降，說明此溫度下光化學(xué)效率受影響[4]。李慶會等[5]通過比較低溫脅迫下2 個茶樹品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，初步判定耐寒性強的品種是‘迎霜’。在對低溫下3 種闊葉樹的光抑制及恢復(fù)研究中發(fā)現(xiàn)，非光化學(xué)猝滅的光保護機制在越冬樹種PSII 免受光抑制中發(fā)揮重要作用[6]。

設(shè)施栽培的草莓，由于冬季低溫，設(shè)施保溫能力及措施不強，往往受到多種低溫傷害，有偶發(fā)、極端、短時性的，也有持續(xù)性傷害，因此研究低溫對草莓的影響在生產(chǎn)中有重要意義。關(guān)于低溫下草莓葉綠素?zé)晒馓匦缘难芯可儆袌蟮?。針對不同草莓品種間響應(yīng)低溫脅迫、低溫穩(wěn)定性差異等問題，本研究以甘肅省主栽的一季品種‘紅顏’和四季品種‘圣安德瑞斯’為試材，利用葉綠素?zé)晒鈪?shù)的瞬變特征，結(jié)合光反應(yīng)中發(fā)生的3 個主要功能步驟（能量吸收、捕獲和轉(zhuǎn)換）[7]，從快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)角度來揭示2 個草莓品種原初光化學(xué)反應(yīng)對低溫脅迫的響應(yīng)，旨在探討2 個草莓品種低溫下原初光化學(xué)反應(yīng)的差異，同時結(jié)合分析相對電導(dǎo)率與葉綠素含量的變化，為進一步揭示草莓應(yīng)對低溫的機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試草莓品種為‘紅顏’（Benihoppe）和‘圣安德瑞斯’（San Andreas），其中，‘紅顏’為一季品種，‘圣安德瑞斯’為四季品種。

1.2 試驗設(shè)計

每個品種選擇長勢一致的匍匐莖苗12 株栽于草炭土為基質(zhì)的黑色營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽高12 cm、直徑12 cm。培養(yǎng)60 d 后植株長有5～6 片葉進行試驗處理。將供試材料置于RXZ 型智能人工氣候箱中，在晝25 ℃/夜20 ℃、空氣相對濕度75%、PFD為200 μmol·m-2·s-1、光周期12 h 條件下進行培養(yǎng)，定期澆水。7 d 后，測定快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)及葉綠素含量和相對電導(dǎo)率。測定后，其余條件不變，溫度降至4 ℃，分別培養(yǎng)1、2、4、6 d 再測定各指標(biāo)。試驗共4 個處理，常溫（25 ℃）培養(yǎng)7 d 為對照。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 葉綠素含量及相對電導(dǎo)率的測定

取新鮮葉片打孔器打孔后混勻，準(zhǔn)確稱取0.1 g，置于10 mL 乙醇∶丙酮（1∶1）提取液中浸提，采用UV-2550 紫外可見分光光度計，分別于665、649 nm 波長下測定吸光度值。相對電導(dǎo)率測定參考李俊才等[8]的方法。以上指標(biāo)測定重復(fù)3 次。

1.3.2 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)

常溫培養(yǎng)7 d 后，于9：00—11：00 測定其中心展開葉往外數(shù)第2 片復(fù)葉中心小葉的快速葉綠素?zé)晒鈪?shù)。標(biāo)記該葉片，分別在4 ℃培養(yǎng)1、2、4、6 d 的9：00—11：00 測定其快速葉綠素?zé)晒鈪?shù)，重復(fù)測定6 次，取平均值。葉片經(jīng)暗適應(yīng)30 min 后，暴露于飽和脈沖光（3 000 μmol·m-2·s-1，PFD）下2 s，用連續(xù)激發(fā)式熒光儀Handy-PEA（Hansatech，UK）繪制快速熒光動力學(xué)曲線。

1.4 JIP-test 分析與數(shù)據(jù)分析

獲得的OJIP 熒光誘導(dǎo)曲線進行JIP-test 分析，可得到以下熒光參數(shù)：最大光化學(xué)效率Fv/Fm=φPo=（Fm-Fo）/Fm；以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)PIabs=（RC/ABC）×［φPo/（1-φPo）］×［ψo/（1-ψo）］；可變熒光Fv占振幅FJ-Fo的比例Wk=（Fk-Fo）/（FJ-Fo）；捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA-下游的其他電子受體的概率ψo=1-VJ；反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額φEo=［1-（Fo/Fm）］×ψo；單位面積有活性的反應(yīng)中心的密度RC/CSo=φPo×（VJ/Mo）×（ABS/CSo）；單位反應(yīng)中心吸收（ABS/RC）、捕獲（TRo/RC）、用于電子傳遞（ETo/RC）及熱耗散的能量（DIo/RC）的計算為ABS/RC=Mo×（1/VJ）×（1/φPo），TRo/RC=Mo×（1/VJ），ETo/RC=Mo×（1/VJ）×ψo，DIo/RC=（ABS/RC）-（TRo/RC）。

采用WPS Office 軟件整理、統(tǒng)計數(shù)據(jù)以及作圖，采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行LSD 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對2 個草莓品種快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線及特殊位點熒光的影響

低溫脅迫導(dǎo)致‘紅顏’和‘圣安德瑞斯’OJIP曲線發(fā)生明顯變化，在O 點已略微升高，在J 點處（2 ms）均高于各自的對照，低溫脅迫1、2 d I 點（30 ms）的值明顯高于對照，在脅迫4、6 d 有所下降，但仍高于對照，且低溫脅迫延長了到達最大熒光所需要的時間（圖1）。

圖1 2 個草莓品種快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線

O 相熒光為初始熒光（Fo），反映反應(yīng)中心受損傷的程度。2 個草莓品種Fo隨著低溫脅迫時間的延長而升高。從脅迫1 d 開始，F(xiàn)o升高，‘紅顏’在低溫脅迫4 d 開始和對照差異顯著；‘圣安德瑞斯’在脅迫1 d 時較對照升高了20.9%，且持續(xù)升高，與對照均呈顯著差異。2 個品種間相比，‘紅顏’在25 ℃處理下（對照），F(xiàn)o值高于‘圣安德瑞斯’，但在低溫脅迫下低于‘圣安德瑞斯’（圖2-A）。低溫處理后J 相（2 ms）的葉綠素?zé)晒鈴姸? 個品種顯著高于各自對照，脅迫導(dǎo)致QB不能及時從QA-接受電子，造成QA-大量積累；低溫脅迫下‘紅顏’J 相的熒光強度隨脅迫時間延長沒有顯著差異，而‘圣安德瑞斯’在脅迫4 d 時降低，又在脅迫6 d 時上升（圖2-B）。I 相（30 ms）的熒光強度在低溫脅迫2 d 略有升高，但隨脅迫時間繼續(xù)延長I 相的熒光強度逐漸降低；‘紅顏’各處理間差異不顯著，‘圣安德瑞斯’各處理間差異較大（圖2-C）。P 相是最大熒光產(chǎn)量（Fm），是反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉狀態(tài)時的葉綠素?zé)晒獍l(fā)射強度，F(xiàn)m值隨著低溫處理時間的延長呈先升高后降低的趨勢，但‘紅顏’差異不顯著，‘圣安德瑞斯’在低溫脅迫4 d 時顯著低于脅迫1 d 和2 d（圖2-D）。2 個品種的FJ、FI、Fm在初始0～2 d 接近，之后的4～6 d‘圣安德瑞斯’變化較大，暗示‘紅顏’光系統(tǒng)II 較‘圣安德瑞斯’穩(wěn)定。

2.2 低溫脅迫對2 個草莓品種PSII 反應(yīng)中心的影響

隨著處理時間的延長，單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）、單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量（TRo/RC）、用于電子傳遞的能量（ETo/RC）及耗散的熱能（DIo/RC）均出現(xiàn)不同程度的變化，通過分析這4 個參數(shù)，可以了解當(dāng)QA處在可還原態(tài)時單位反應(yīng)中心活性的變化情況（表1）。常溫下2個草莓品種反應(yīng)中心各參數(shù)的差別不大。低溫脅迫使2 個草莓品種單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）減少，單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量（TRo/RC）有所降低，用于電子傳遞的能量（ETo/RC）也是顯著低于各自對照，熱耗散的能量（DIo/RC）隨低溫脅迫時間的延長在6 d 時均高于各自對照，且‘圣安德瑞斯’在低溫脅迫4 d 開始高于‘紅顏’。

圖2 2 個草莓品種特殊位點熒光對低溫脅迫的響應(yīng)

RC/CSo反應(yīng)的是單位面積內(nèi)有活性反應(yīng)中心的數(shù)量。結(jié)果顯示，低溫脅迫使2 個草莓品種的RC/CSo與對照相比數(shù)量增多?！t顏’的RC/CSo在低溫脅迫下差異不顯著，脅迫6 d 時‘紅顏’和‘圣安德瑞斯’分別較對照升高了26.2%和24.8%。2 個品種間相比，‘紅顏’的RC/CSo增加幅度在低溫脅迫1 d 和2 d 時少于‘圣安德瑞斯’，但隨著脅迫時間延長變化穩(wěn)定，‘圣安德瑞斯’則出現(xiàn)較大變動，且‘紅顏’反應(yīng)中心數(shù)量增加后吸收的能量多用于推動電子傳遞（ETo/RC），而‘圣安德瑞斯’熱耗散能量（DIo/RC）增加的較多。可見，‘圣安德瑞斯’在低溫脅迫后期（6 d），雖然單位反應(yīng)中心吸收的光能較‘紅顏’多，但是沒有將吸收的能量更多地用于推動電子傳遞，而是通過熱耗散減輕對植株的傷害。

表1 低溫脅迫對2 個草莓品種葉片單位PSII 反應(yīng)中心活性的影響

2.3 低溫脅迫對2 個草莓品種PSII 供體側(cè)的影響

Wk是K 相可變熒光Fk占振幅FJ-FO的比例，通過比較Wk的升高程度可看出放氧復(fù)合體被破壞的程度[9]。從圖3 可以看出，隨著低溫脅迫時間的延長，2 個草莓品種的Wk均低于各自對照，結(jié)合OJIP曲線中K 相未出現(xiàn)，進一步表明2 個草莓品種葉片PSII 供體側(cè)在4 ℃低溫下沒有受到傷害。

圖3 2 個草莓品種葉片K 相可變熒光Fk占振幅FJ-FO的比例

2.4 低溫脅迫對2 個草莓品種ψo和φEo的影響

葉片反應(yīng)中心捕獲的激子中，電子傳遞到QA以下的效率（ψo）隨低溫脅迫時間的延長而降低，‘紅顏’ψo在低溫脅迫1 d 時下降了18.6%，脅迫2、4、6 d 時分別下降了20.0%、27.1%、27.4%；而‘圣安德瑞斯’在低溫脅迫1 d 時下降了22.0%，脅迫2、4、6 d 時分別下降了23.1%、23.2%、26.1%；與各自對照相比，2 個草莓品種差異均顯著（圖4）。φEo反映了反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額，值越高表明植物受低溫脅迫的影響越小。2 個草莓品種的φEo均降低，低溫脅迫1 d 時‘紅顏’下降了18.8%，脅迫2、4、6 d 時分別下降了20.3%、28.9%、29.5%；‘圣安德瑞斯’的φEo在低溫脅迫1 d 時下降了23.0%，下降幅度較大，脅迫2、4、6 d時分別下降了24.2%、27.5%、29.8%（圖4）。從圖4 還看出，2 個草莓品種的ψo、φEo在低溫脅迫1～2 d 有差異，而之后的6 d 出現(xiàn)趨同。

圖4 低溫脅迫對2 個草莓品種葉片ψo和φEo的影響

2.5 低溫脅迫對2 個草莓品種Fv/Fm和PIabs的影響

Fv/Fm反映了暗反應(yīng)后最大光化學(xué)效率，其值的下降是發(fā)生光抑制的重要指標(biāo)。從圖5 可以看出，2 個草莓品種的Fv/Fm隨低溫脅迫時間的延長整體呈現(xiàn)下降趨勢，但在脅迫1 d 和2 d 時與各自對照相比變化不大，脅迫4 d 開始，F(xiàn)v/Fm與對照差異顯著；常溫條件下2 個草莓品種葉片的Fv/Fm相近，但低溫脅迫條件下‘紅顏’葉片的Fv/Fm均高于‘圣安德瑞斯’?？芍蜏孛{迫開始時‘紅顏’和‘圣安德瑞斯’葉片受到輕微光抑制，但在脅迫4 d 開始，2 個草莓品種光抑制均嚴(yán)重，且‘圣安德瑞斯’更嚴(yán)重。

圖5 低溫脅迫對2 個草莓品種葉片F(xiàn)v/Fm和PIabs的影響

PIabs是以吸收光能為基礎(chǔ)的性能參數(shù)，反映低溫脅迫對光合機構(gòu)的影響。2 個草莓品種的PIabs隨低溫脅迫時間延長而逐漸降低。與各自對照相比，‘紅顏’在低溫脅迫1、2、4、6 d 的PIabs分別下降了22.6%、31.1%、50.6%、52.7%，‘圣安德瑞斯’分別下降了35.0%、37.4%、51.3%、52.5%。常溫條件下2 個草莓品種的PIabs幾乎相等；4 ℃脅迫1 d和2 d 時，‘紅顏’的PIabs高于‘圣安德瑞斯’，但脅迫4 d 后二者趨同。

2.6 低溫脅迫對2 個草莓品種相對電導(dǎo)率和葉綠素含量的影響

低溫傷害首先作用于細(xì)胞膜上，相對電導(dǎo)率可以反映植株受傷害程度。由圖6 可知，常溫下，2個草莓品種葉片相對電導(dǎo)率幾乎相等，低溫脅迫1 d‘圣安德瑞斯’葉片相對電導(dǎo)率高于‘紅顏’，但在脅迫2、4、6 d 時略低于‘紅顏’。這說明‘圣安德瑞斯’在低溫下葉片細(xì)胞膜狀態(tài)沒有‘紅顏’穩(wěn)定。

圖6 低溫脅迫對2 個草莓品種葉片相對電導(dǎo)率的影響

低溫延長處理降低了‘紅顏’葉片中葉綠素含量（表2），其中在脅迫6 d 時葉綠素a 含量降低了7.9%，葉綠素b 含量降低了26.6%，導(dǎo)致葉綠素a/b值高于對照?！グ驳氯鹚埂诘蜏孛{迫6 d 時葉綠素a 含量降低了4.3%，葉綠素b 含量降低了16.7%，葉綠素含量尤其是葉綠素b 含量的降低，降低了草莓葉片對光的捕獲能力。2 個品種相比，常溫下葉綠素b 含量‘紅顏’高于‘圣安德瑞斯’，在低溫脅迫6 d 時二者葉綠素b 含量幾乎相等。

表2 低溫脅迫對2 個草莓品種葉片葉綠素含量的影響

3 討論與結(jié)論

通過JIP-test 分析的各參數(shù)值可以反映植物光系統(tǒng)Ⅱ?qū)饽艿睦们闆r[10]。逆境中Fo上升，F(xiàn)J、FI和Fm下降，說明電子在PSⅡ受體側(cè)的傳遞受到阻礙，QB和PQ 被還原的能力受到限制，電子傳遞活性降低[11-13]，光化學(xué)效率（Fv/Fm）下降，表明光合機構(gòu)被逐漸破壞。本研究表明，隨低溫脅迫時間延長‘圣安德瑞斯’各參數(shù)值變化較大，受到的影響更嚴(yán)重。K 點出現(xiàn)是和供體側(cè)特別是放氧復(fù)合體受到傷害有關(guān)。從Wk的變化看出，2 個草莓品種葉片PSⅡ反應(yīng)中心供體側(cè)沒有受到明顯傷害，這和孫山等[14]在低溫弱光脅迫下‘金太陽’杏結(jié)果一致，任麗麗等[15]也認(rèn)為一定條件的低溫弱光脅迫不會對放氧復(fù)合體造成傷害。但PSⅡ向下游電子傳遞鏈傳遞電子的能力（ψo）不斷下降，意味著受到傷害的是PSⅡ受體側(cè)的電子傳遞鏈。

大多數(shù)情況下，低溫導(dǎo)致有活性反應(yīng)中心的減少[14-15]，但本試驗中RC/CSo值增大，有活性反應(yīng)中心單位密度反而增加，Rachid 等[3]發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下藜麥也有類似結(jié)果，認(rèn)為有活性的RC轉(zhuǎn)化為鈍化的RC，為了適應(yīng)逆境，通過增加單位面積有活性的反應(yīng)中心密度來提高光能轉(zhuǎn)化為激發(fā)能的效率，這是一種適應(yīng)低溫能力[16]。鄭毅[17]認(rèn)為部分鈍化的PSⅡ仍具有啟動熱耗散保護機制的功能。從孫山等[14]分析中不難發(fā)現(xiàn)，PSⅡ反應(yīng)中心在某些逆境下易形成能量陷阱，能吸收光能但不推動電子傳遞，本試驗很好地印證了這一論斷：低溫脅迫后期，‘圣安德瑞斯’的RC/CSo減少，單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）多于‘紅顏’，但并沒有將吸收的光能用于推動電子傳遞，只是較多用于熱耗散，形成能量陷阱，反觀‘紅顏’，雖吸收的光能少，但多用來推動電子傳遞，低溫脅迫下電子傳遞效率降低是導(dǎo)致耐寒性差異的主要原因[18]。有人認(rèn)為植物在受到環(huán)境威脅時，反應(yīng)中心利用光能的效率會降低，體內(nèi)過剩光能對細(xì)胞造成損傷，熱耗散（DIo/RC）是植物應(yīng)對氧化脅迫的重要防御機制。但筆者更傾向于高玉錄等[19]的分析，認(rèn)為熱耗散的增加是因為PSII 活性受到了抑制。

性能指數(shù)是反映光化學(xué)反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，能更好地反映脅迫對光合機構(gòu)的影響[20]。在對30 個大豆品種抗寒性研究發(fā)現(xiàn)，低溫下PIabs指數(shù)既反應(yīng)不同大豆品種抗寒能力差異，又顯示反應(yīng)中心吸收光能的能力差異[7]。本試驗中2 個草莓品種的光能利用能力（PIabs）支持上述觀點，與‘圣安德瑞斯’相比，‘紅顏’脅迫下PIabs下降幅度較緩，抗性強。最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）下降是PSII 發(fā)生光抑制的重要指標(biāo)，但Fv/Fm是有活性和無活性反應(yīng)中心光化學(xué)效率的平均值[21]，對環(huán)境變化有一定的不敏感性，比起Fv/Fm，PIabs更能敏感地反映葉片光合效率的變化[22]。本試驗結(jié)果進一步論證，隨著低溫脅迫時間的延長，PIabs確實比Fv/Fm變化敏感，在脅迫初期光合機構(gòu)就有所響應(yīng)。

植物均有低溫適應(yīng)的能力，但不同品種間具有一定的差異。多數(shù)學(xué)者通過電導(dǎo)率及生理指標(biāo)的測定分析，綜合評價作物在低溫環(huán)境中的適應(yīng)性。本試驗中利用JIP-test 分析2 個草莓品種各參數(shù)值的變化與低溫脅迫下電導(dǎo)率及光合色素含量變化分析結(jié)果一致：與‘圣安德瑞斯’相比，一季品種‘紅顏’在低溫狀態(tài)下具有更強的適應(yīng)性。但低溫脅迫對植物葉綠素?zé)晒馓匦缘囊种谱饔檬黔h(huán)境脅迫和植物響應(yīng)恢復(fù)能力共同作用的結(jié)果，有關(guān)低溫脅迫時間延長后2 個草莓品種恢復(fù)能力如何，仍需進一步研究。