龍 凱 王 娟

云南省紅河州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 蒙自 661199

治咳川貝枇杷露收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部，有清熱化痰、消炎止咳的功效，多用于感冒及支氣管肺炎引起的咳嗽[1]。其中添加的苯甲酸、羥苯乙酯作為防腐劑，可以起到防止微生物污染、霉變的作用，并能保證口服液的穩(wěn)定性，但如果添加過(guò)量會(huì)對(duì)人體造成一定的傷害。分別測(cè)定藥品中苯甲酸[2]、羥苯乙酯[3-6]的含量有文獻(xiàn)報(bào)道，尚無(wú)同時(shí)測(cè)定苯甲酸和羥苯乙酯含量的相關(guān)報(bào)道，為對(duì)兩種防腐劑進(jìn)行質(zhì)量控制，保證用藥的安全性，本研究采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定苯甲酸和羥苯乙酯的含量。

1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀，配置DAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫)；Sartorius BP211D電子天平(德國(guó)賽多利斯)。苯甲酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100419-201703,含量99.9%)；羥苯乙酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100847-201604，含量99.9%)；治咳川貝枇杷露(廣州白云山潘高壽藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1902014A；1906012A；1909027A)；甲醇(色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易上海有限公司)；水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.02 moL·L-1乙酸銨溶液，梯度程序見表1；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)見表2；進(jìn)樣量： 10 μL；柱溫：25 ℃。

表1 梯度程序

表2 檢測(cè)波長(zhǎng)

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取羥苯乙酯對(duì)照品10.26 mg,制成每1 mL含羥苯乙酯2.05 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密稱取苯甲酸對(duì)照品25.06 mg，精密量取上述羥苯乙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL,置同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解，制成每1 mL含苯甲酸0.25 mg、羥苯乙酯0.02 mg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例配制不含苯甲酸和羥苯乙酯的陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按2.1 色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示，圖中可見待測(cè)成分與其他物質(zhì)分離良好，分離度均大于1.5，理論板數(shù)：苯甲酸5541，羥苯乙酯195205。陰性對(duì)照溶液色譜圖在待測(cè)成分相應(yīng)位置無(wú)干擾峰，表明其他成分對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無(wú)干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.2.1對(duì)照品溶液各4、8、12、16、20 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，苯甲酸在1.00～5.01 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，A=3768.46170X-7.19021，r=0.9999；羥苯乙酯在0.08～0.41 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，A=5895.21755X-2.94636，r=1.0000。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1對(duì)照品溶液10 μL，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果苯甲酸、羥苯乙酯峰面積RSD分別為0.43%，0.52%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2供試品溶液分別于0、1、2、4、8、12 h測(cè)定，苯甲酸、羥苯乙酯峰面積RSD分別為 0.57%、0.47%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)1909027A的樣品，制備供試品溶液6份，在2.1色譜條件下測(cè)定，6份樣品中苯甲酸的平均含量為344.50 mg/瓶，RSD為0.45%(n=6)；羥苯乙酯的平均含量為13.21 mg/瓶，RSD為0.35%(n=6)。表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加標(biāo)回收試驗(yàn) 精密量取已知苯甲酸、羥苯乙酯含量的樣品(批號(hào)：1909027A)共9份，精密加入不同體積的2.2.1對(duì)照品溶液，照2.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.4 樣品含量測(cè)定 取治咳川貝枇杷口服液樣品3批，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算苯甲酸和羥苯乙酯的含量。結(jié)果見表4。

表4 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=2)

3 討論

曾考察甲醇-水對(duì)苯甲酸的分離效果，發(fā)現(xiàn)苯甲酸不能與相鄰峰完全分離，且峰型拖尾嚴(yán)重。而使用甲醇-0.02 moL·L1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)苯甲酸、羥苯乙酯均能與相鄰峰有較好的分離度，且峰型較好。因此本方法采用甲醇-0.02 moL·L-1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。

利用高效液相色譜儀的光譜功能對(duì)進(jìn)樣的2.2.1對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)苯甲酸在230 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，羥苯乙酯在254 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。故采用分時(shí)段變換波長(zhǎng)信號(hào)的檢測(cè)方式來(lái)對(duì)苯甲酸和羥苯乙酯的含量進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)靈敏度高、相互無(wú)干擾，可以同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。

口服溶液在使用過(guò)程中應(yīng)避免微生物的污染，防腐劑的抑菌作用是必要的。用量過(guò)多會(huì)對(duì)人體肝臟功能產(chǎn)生損害，《中國(guó)藥典》2015年版四部[7]通則中規(guī)定合劑中苯甲酸的用量不得超過(guò)0.3%，羥苯乙酯的用量不得超過(guò)0.05%。測(cè)定的3批樣品苯甲酸和羥苯乙酯的用量均在規(guī)定范圍內(nèi)。本方法可以在20 min內(nèi)測(cè)定其含量，方法靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，為其含量的分析提供了理想的方法。