王平，孟立平，劉龍斌，郭航遠(yuǎn)，3，4

1.紹興市人民醫(yī)院 浙江大學(xué)紹興醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000；2.紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院 紹興市立醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 研究生院，浙江 溫州 325035；4.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興 312000

糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是發(fā)生在糖尿病患者身上的一種獨(dú)立于冠心病、心臟瓣膜病等心血管疾病的影響心臟結(jié)構(gòu)和功能的病變[1]。糖代謝異常及微血管病變所引起的心肌細(xì)胞凋亡和心臟纖維化是DCM的主要病理特征，導(dǎo)致患者心功能損害，并最終進(jìn)展為心力衰竭、心律失常及心源性休克。隨著糖尿病的發(fā)病率在全球逐年增加，DCM的發(fā)病率也隨之升高，已成為影響糖尿病患者生活質(zhì)量以及預(yù)后的重要因素[2]。

心臟成纖維細(xì)胞的激活和心肌細(xì)胞的變性是心臟重構(gòu)的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，也是DCM形成的病理生理基礎(chǔ)[2]。心臟成纖維細(xì)胞由靜止型活化為激活型，增殖和遷移能力增加，并開(kāi)始大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)，分泌MMP-2和TIMP-1等影響細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的蛋白酶，造成心臟間質(zhì)的纖維化，最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)[3-4]。

鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodiumglucose cotransporter，SGLT）屬于溶質(zhì)載體5基因家族，以消耗能量的方式逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，在葡萄糖的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要的作用[5]。我們過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)高糖可以促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞中SGLT1和MMP-2的表達(dá)[6]，但是高糖是否是通過(guò)誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞激活從而促進(jìn)心臟的纖維化，SGLT1是否參與高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索高糖是否能促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的激活以及SGLT1在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 葡萄糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、胰酶以及青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基（用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)）、DMEM高糖培養(yǎng)基（用于原代細(xì)胞培養(yǎng)）、PBS購(gòu)自杭州吉諾公司；MTT、EdU購(gòu)自美國(guó)Emresco公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司；DAPI購(gòu)自美國(guó)Rcohe公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol RNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京Promega公司；si-SGLT1購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物公司；SGLT1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcom公司；辣根過(guò)氧化酶及FITC標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson公司；蛋白免疫印跡相關(guān)試劑購(gòu)自蘇州碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組及干預(yù)：為了探索高糖對(duì)心臟成纖維細(xì)胞激活的影響，用不同濃度的葡萄糖干預(yù)心臟成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞分為4組，對(duì)照組（不加任何干預(yù)因素），5.5 mmol/L葡萄糖組，30 mmol/L葡萄糖組，100 mmol/L葡萄糖組。為了進(jìn)一步探索SGLT1在高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活中的作用，將帶有si-SGLT RNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞中抑制細(xì)胞中SGLT1的表達(dá)，將細(xì)胞分為3組，對(duì)照組（不加任何干預(yù)因素），高糖組（加濃度為30 mmol/L的葡萄糖），si-SGLT1組（在轉(zhuǎn)染si-SGLT質(zhì)粒之后，再加入30 mmol/L的葡萄糖）。

1.2.2 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：取4～7代培養(yǎng)細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化單層心臟成纖維細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化。各組細(xì)胞按上述分組分別干預(yù)，細(xì)胞于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，光鏡記錄各組細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：每孔6×103個(gè)心臟成纖維細(xì)胞接種于96 孔板中。各組細(xì)胞按上述分組加入對(duì)應(yīng)濃度的干預(yù)因子，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，2個(gè)不加細(xì)胞的空白對(duì)照孔。細(xì)胞于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束，每孔加入MTT液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4～6 h，終止培養(yǎng)，小心棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，選擇490 nm波長(zhǎng)于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光值并記錄。以時(shí)間為橫軸，吸光值為縱軸繪制心臟成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 EdU法測(cè)細(xì)胞增殖能力：將按上述分組要求處理的細(xì)胞調(diào)整濃度為1×104/mL，取100 μL接種于96孔板，用EdU孵育2 h后用多聚甲醛固定，流水沖洗后，用2 μg/mL的DAPI染核，PBS沖洗后，熒光顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)和EdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并記錄。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)細(xì)胞遷移能力：細(xì)胞鋪滿板底后，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，加入1.8 mmol/L羥基脲作用12 h抑制細(xì)胞增殖。用100 μL黃色槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。加入各組相應(yīng)的干預(yù)因子，拍照記錄0、12、24、48、72、96 h圖片，用Image Pro Plus 6.0分析計(jì)算出細(xì)胞遷移的面積，細(xì)胞遷移的面積與最開(kāi)始的劃痕面積的比值表示遷移的多少。

1.2.6 Transwell法測(cè)細(xì)胞遷移能力：取4～7 代心臟成纖維細(xì)胞，血清饑餓使細(xì)胞同步化，加入1.8 mmol/L羥基脲作用12 h抑制細(xì)胞增殖，0.25%胰蛋白酶消化單層心臟成纖維細(xì)胞，用含有各組干預(yù)因子的DMEM培養(yǎng)基（無(wú)血清）配成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)（3×104/mL）。各組24孔板配套的Transwell小室（0.8 μm）上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL，分別培養(yǎng)4、8、12、24、48 h。干預(yù)結(jié)束后以棉簽輕輕擦去上層未穿透膜的細(xì)胞，取下Transwell半透膜，TBS洗滌3次，3.7%多聚甲醛室溫固定5 min，流水沖洗后，用2 μg/mL的DAPI染核，PBS沖洗后，熒光顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)并記錄。

1.2.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株：si-SGLT1 質(zhì)粒的構(gòu)建：si-SGLT1質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)合成，通過(guò)PubMed查找SGLT1基因的序列，引物根據(jù)GeneBank中SGLT1 mRNA序列設(shè)計(jì)引物。si-SGLT1基因和質(zhì)粒DNA連接后，篩選重組質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證。轉(zhuǎn)染：將心臟成纖維細(xì)胞系接種至6孔板，生長(zhǎng)至50%～70%密度時(shí)，以脂質(zhì)體3000分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒或si-SGLT1質(zhì)粒各100 pmol 24 h后，提取總RNA/蛋白后，PCR/Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.8 熒光定量RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)：提取細(xì)胞中總RNA，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：16 ℃（30 min），45 ℃（30 min），85 ℃（5 min）。運(yùn)用SYBR Green法檢測(cè)SGLT1、SMα、Tcf21的表達(dá)情況，反應(yīng)條件為：94 ℃（15 min），94 ℃（30 s），60 ℃（30 s），72 ℃（30 s），共循環(huán)40次；最后72 ℃延伸8 min。每次擴(kuò)增設(shè)置無(wú)模板cDNA的陰性對(duì)照，內(nèi)參基因GAPDH為陽(yáng)性對(duì)照。每組樣品重復(fù)3 次，試驗(yàn)重復(fù)3 次，使用2-△△Ct法計(jì)算各標(biāo)本中mRNA的表達(dá)。

圖1 高糖誘導(dǎo)的活化成纖維細(xì)胞的形態(tài)

圖2 高糖促進(jìn)細(xì)胞遷移

1.2.9 Western blot測(cè)定心臟成纖維細(xì)胞中SGLT1的表達(dá)：各個(gè)干預(yù)因子干預(yù)48 h之后，裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE膠每孔加入20 μL樣品，80 V 30 min進(jìn)行蛋白濃聚，120 V 2 h進(jìn)行凝膠電泳，并用孔徑0.45 μm硝酸纖維素膜250 mA 90 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢經(jīng)常溫下TBST洗膜3次、脫脂奶粉封閉2 h后加入SGLT1一抗（1:1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)蛋白。暗室柯達(dá)膠片顯影，Quantity One軟件定量分析。

圖3 高糖促進(jìn)細(xì)胞增殖

圖4 高糖增加激活型成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

1.2.10 免疫熒光法檢測(cè)各組中SGLT1在細(xì)胞中的分布及表達(dá)：將細(xì)胞接種于96孔板，每孔3 000～5 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加入各組干預(yù)因子，在細(xì)胞融合之前進(jìn)行檢測(cè)。先PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25% Triton×100穿破細(xì)胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋了250倍的anti-SGLT1抗體，4 ℃過(guò)夜，PBST清洗3遍之后加入結(jié)合有FICT或者FRICT的二抗，室溫孵育1 h后PBST清洗3遍，熒光顯微鏡拍照后Iamge Pro Plus 6.0分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0軟件分析。計(jì)量資料以±s 表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 高糖促進(jìn)成纖維細(xì)胞中SGLT1的表達(dá)（免疫熒光，×100）

圖6 si-SGLT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率（×20）

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響 光鏡下各組細(xì)胞的形態(tài)不同，對(duì)照組中的心臟成纖維細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，呈典型的梭形，用不同濃度的高糖干預(yù)后，細(xì)胞失去細(xì)長(zhǎng)的形態(tài)，逐漸變短，變圓，見(jiàn)圖1。

2.2 高糖促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的遷移能力 劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在加入各組干預(yù)因素后，相比于對(duì)照組，30、100 mmol/L葡萄糖組細(xì)胞遷移能力增加（P＜0.05），且隨葡萄糖的濃度增加而增加，見(jiàn)圖2。

2.3 高糖促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖能力 EdU實(shí)驗(yàn)和MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，30、100 mmol/L葡萄糖促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖（P＜0.05），且隨葡萄糖濃度增加而增強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

2.4 高糖促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞中SMα、Tcf21 的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，30、100 mmol/L葡萄糖組細(xì)胞中SMα和Tcf21的表達(dá)增加（P＜0.05），并與葡萄糖的濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)圖4。

2.5 高糖促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞中SGLT1 的表達(dá)RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，30、100 mmol/L葡萄糖組細(xì)胞中SGLT1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)都增加（P＜0.05）；免疫熒光染色結(jié)果顯示心臟成纖維細(xì)胞中有SGLT1的表達(dá)，SGLT1主要表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)而非細(xì)胞膜上，并且高糖可以增加細(xì)胞中SGLT1的表達(dá)。見(jiàn)圖5。

2.6 熒光顯微鏡及PCR觀察轉(zhuǎn)染效率 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6 h后，于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)帶有熒光的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，RT-qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示，si-SGLT1組細(xì)胞中SGLT1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

2.7 高糖通過(guò)上調(diào)SGLT1促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞激活相較于30 mmol/L葡萄糖組，si-SGLT1組細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞遷移能力和增殖能力減弱，細(xì)胞中SMα、Tcf21和SGLT1的表達(dá)降低（P＜0.05），提示敲除SGLT1可以抑制高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活，見(jiàn)圖7。

3 討論

在正常心臟組織中，心臟成纖維細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，主要起構(gòu)成心臟網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)的作用。靜止型心臟成纖維細(xì)胞外觀呈梭形，增殖和遷移能力弱[7]。當(dāng)受到各種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、物理張力等病理刺激的作用下，靜止型的心臟成纖維細(xì)胞被激活，轉(zhuǎn)化成激活型的成纖維細(xì)胞。激活型的細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：①各種促炎和促纖維化因子表達(dá)水平升高，直接促成炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增殖；②分泌高水平的MMP以促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移；③促進(jìn)膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積，導(dǎo)致瘢痕形成；④表達(dá)SMα、Tcf21等特異性的標(biāo)志蛋白[3，8-10]。在各種病理因子的刺激下，被激活的心臟成纖維細(xì)胞大量增殖遷移并分泌MMP-2等促進(jìn)心臟重構(gòu)的蛋白酶，最終導(dǎo)致心臟纖維化瘢痕組織的形成和心臟的重構(gòu)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖可以改變心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，并且增加細(xì)胞中SMα和Tcf21的表達(dá)，上述結(jié)果表明高糖可以促經(jīng)心臟成纖維細(xì)胞的激活。這可能是高糖引起心臟纖維化和心臟重構(gòu)，最終導(dǎo)致DCM形成的病理機(jī)制。

SGLT1以消耗能量的方式逆濃度梯度將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，在機(jī)體的糖代謝中具有重要的作用。過(guò)去認(rèn)為SGLT1只表達(dá)于小腸刷狀緣和腎近曲小管，在人體其他器官?zèng)]有表達(dá)，ZHOU等[11]的研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中也有SGLT1的表達(dá)，并且陸續(xù)有研究報(bào)道心臟中SGLT1的表達(dá)與一些心臟疾病密切相關(guān)。BANERJEE等[12]通過(guò)檢測(cè)死亡患者的心臟標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)SGLT1在缺血性心肌病和擴(kuò)張性心肌病患者心臟中表達(dá)增加。同樣的，DI FRANCO等[13]通過(guò)檢測(cè)9例缺血性心肌病和5例肥厚性心肌病患者的心臟組織，發(fā)現(xiàn)SGLT1的表達(dá)增加。我們過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)除心肌細(xì)胞之外，心臟成纖維細(xì)胞中也有SGLT1的表達(dá)[6]。但是，心臟成纖維細(xì)胞中的SGLT1是否參與DCM的進(jìn)程，SGLT1在DCM的發(fā)生發(fā)展中起到了怎樣的作用，目前尚未見(jiàn)有研究報(bào)道。

MARGOLSKEE等[14]發(fā)現(xiàn)高糖可以促進(jìn)SGLT1在小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)，LEE等[15]發(fā)現(xiàn)葡萄糖還可以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞中SGLT1的表達(dá)。與上述研究結(jié)果相似，本研究用不同濃度的葡萄糖干預(yù)心臟成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高糖可以促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的激活的同時(shí)，也可以促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞中SGLT1的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SGLT1在高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活中的作用，我們使用si-SGLT1預(yù)先敲除細(xì)胞中SGLT1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)si-SGLT1可以抑制高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活，上述結(jié)果表明高糖通過(guò)上調(diào)SGLT1促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞激活。

SGLT1是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在DCM的發(fā)展過(guò)程中，心臟一直處于高糖負(fù)荷狀態(tài)，高糖上調(diào)的SGLT1可以將更多的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入心臟成纖維細(xì)胞，增加細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和能量負(fù)荷，進(jìn)一步引起細(xì)胞內(nèi)的代謝紊亂，最終導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞的激活[12，16-17]?；谝陨戏治?，結(jié)合我們過(guò)去發(fā)現(xiàn)的SGLT1抑制劑可以降低高糖誘導(dǎo)的MMP-2的表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡這一結(jié)果[6]，推測(cè)抑制SGLT1可以減少高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活，對(duì)糖尿病患者來(lái)講，SGLT1抑制劑具有心臟保護(hù)作用。