楊光露 郭楊△ 馬勇 涂鵬程 孫杰 許煒民 吳承杰

椎間盤退行性病變(Intervertebral Disc Degeneration，IDD)是腰椎間盤突出癥、盤源性腰痛等骨科常見疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理過程[1-2]，一般多發(fā)于中老年人[3]，但隨著互聯(lián)網(wǎng)應(yīng)用的普及和生活節(jié)奏的加快，IDD越來越多在中青年人群中發(fā)現(xiàn)，加重了社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。研究表明IDD的進(jìn)展受到多種因素如椎體力學(xué)失衡、炎癥、代謝疾病等的影響[5-8]。退變椎間盤在炎性因子及降解酶(如白細(xì)胞介素1(Interleukin-1，IL-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)等)的浸潤下，使二型膠原(Collagen Ⅱ，COL2A1)、蛋白多糖(Aggrecan)等髓核基質(zhì)大分子分解增加，最終造成椎間盤基質(zhì)的生物力學(xué)特性不斷喪失[9-12]。因此抑制炎性因子及降解酶的生成，促進(jìn)基質(zhì)合成對改善IDD尤為重要。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康SPF(無特定病原體)級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由南京青龍山動物中心提供，動物許可證號SCXK(浙)2019-0002。

1.2 實驗藥物及試劑

扶陽宣痹湯，國家發(fā)明專利ZL201711188654.1。組合：黃芪30 g，桂枝30 g，白芍30 g，附子12 g，薏苡仁12 g，甘草10 g，干姜6 g等。飲片購自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科。腰痹通膠囊(中國康緣公司，401206)；蘇木精-伊紅(HE)染色液(中國雷根公司，DH0006)；MMP9、MMP13、GAPDH抗體(美國Proteintech公司，10375-2-AP，18165-1-AP，10494-1-AP)；Aggrecan及COL2A1抗體、羊抗兔二抗(美國Abcam公司，ab36861，ab188570，ab205718)；ReverTraAce qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix定量試劑盒(日本TaKaRa公司，批號RR036A及RR820A)。

1.3 實驗儀器

PharmaScan 7.0T小動物磁共振成像系統(tǒng)(德國Bruker公司)；PerkinElmer酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)自動系列化分析儀(美國ABI公司)，化學(xué)發(fā)光成像儀(美國GE Healthcare公司)，蛋白半干轉(zhuǎn)印儀及電泳儀(美國Bio-Bad公司)，微孔板離心機(jī)及各量程移液器(德國Eppendorf公司)，生物顯微鏡-圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)，全自動硬組織切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1造模方法 除空白組外均需要采用尾椎纖維環(huán)穿刺法制備椎間盤退變模型。模型制備：按Bian[13]的方法，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，消毒大鼠尾部，29G針頭行尾椎穿刺，穿刺節(jié)段為Co5/6/7，避開大鼠尾動靜脈，向椎間盤中心，穿刺深度為5 mm，刺入椎間隙后針頭旋轉(zhuǎn)360°留置10 s，碘伏消毒并標(biāo)記位置后給予創(chuàng)可貼保護(hù)。

1.4.2分組方法 將大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，腰痹通組，扶陽宣痹湯低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。

1.4.3干預(yù)方法 造模成功后，根據(jù)不同動物等效劑量的折算系數(shù)表[14]，空白組、模型組均給予生理鹽水(10 mL/(kg·d))；腰痹通組給予腰痹通溶液(0.34 g/(kg·d))，扶陽宣痹湯低、中、高劑量組分別給予扶陽宣痹湯低劑量(8.19 g/(kg·d))、中劑量(16.38 g/(kg·d))、高劑量(32.76 g/(kg·d))，連續(xù)給藥4周。

1.4.4標(biāo)本制作方法 大鼠給藥治療4周后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，脫頸處死，取整條尾椎于冰上，分離Co5/6/7椎間盤組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗后，Co5置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色和免疫組化觀察椎間盤退變；Co6及Co7置于-80 ℃保存，用于蛋白免疫印跡法(Western Blot)及PCR檢測。

1.5 實驗指標(biāo)測定

磁共振成像(MRI)檢測椎間盤退變：給藥4周后，每組大鼠隨機(jī)抽取3只，利用小動物磁共振成像系統(tǒng)(7.0T)掃描大鼠脊柱尾椎椎間盤組織形態(tài)，獲取尾椎間盤及髓核信號變化并采用Piffimann椎間盤評分系統(tǒng)進(jìn)行評估，計算椎間盤的退變率[15]。

HE染色檢測椎間盤病理變化：每組大鼠隨機(jī)抽取3只，大鼠處死后取標(biāo)記位置的Co5椎間盤組織，經(jīng)4%多聚甲醛中固定24 h，甲酸脫鈣液脫鈣72 h，再經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，浸蠟，常規(guī)包埋，石蠟切片，厚度約6 μm；依次烤片過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，再經(jīng)伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，最后顯微鏡下觀察，各組椎間盤組織進(jìn)行病理學(xué)Masuda 評分[16]。

免疫組化檢測COL2A1及Aggrecan表達(dá)：取各組3只大鼠進(jìn)行椎間盤石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化同HE染色，化后切片浸于檸檬酸緩沖液中沸水浴25 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加2%過氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，再向切片滴加10%山羊血清，室溫封閉1 h，漂洗后滴加一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜，漂洗后滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，再經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液染色10 min，蘇木素浸染1 min，流水沖洗5 min后依次脫水、透明、封片，顯微鏡觀察每組取3張切片，每張切片隨機(jī)選取3個不重疊的高倍視野并利用Image-Pro Plus 5.0軟件對圖像進(jìn)行分析。

實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測COL2A1、Aggrecan、MMP9及MMP13的mRNA表達(dá)：各組大鼠隨機(jī)抽取3只，從Co6/7椎間盤中提取髓核組織，柱提法提取總RNA，使用ReverTraAce qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix定量試劑盒配制20 μL體系進(jìn)樣，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行分析，根據(jù)公式2-△△Ct進(jìn)行半定量計算分析，檢測目標(biāo)分子引物序列(見表1)。

Western Blot檢測MMP9及MMP13蛋白的表達(dá)：隨機(jī)抽取3只大鼠，將取出的Co6/7椎間盤加入RIPA裂解液充分研磨后冰上裂解，離心收集總蛋白，經(jīng)二辛可寧酸(BCA)法定量后，取等量蛋白樣品加入等體積緩沖液，煮沸10 min后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳(90 min)，轉(zhuǎn)膜(60 min)，5%奶粉室溫封閉(2 h)，一抗(1∶1 000) 4 ℃過夜孵育，二抗(1∶10 000)室溫孵育(2 h)，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像檢測MMP9及MMP13蛋白的表達(dá)，用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

表1 目標(biāo)分子引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 椎間盤退變的MRI檢查及Piffimann椎間盤評分

模型制備4周后行MRI影像學(xué)檢查，空白組的尾椎間盤T2加權(quán)像下呈明顯的高信號，而模型組的尾椎間盤信號強(qiáng)度降低，其Piffimann椎間盤評分(7.333±1.211)與空白組(4.667±1.366)相比明顯升高(P=0.018)，表示尾椎間盤退變模型制備成功。給藥4周后，MRI結(jié)果顯示：與模型組(10.000±1.789)相比，扶陽宣痹湯低劑量組(8.667±3.141)、中劑量組(7.667±1.367)、高劑量組(5.333±0.516)大鼠椎間盤信號強(qiáng)度均有不同程度地增強(qiáng)，其中扶陽宣痹湯高劑量組的Piffimann椎間盤評分明顯下降(P=0.006)，高劑量組與腰痹通組(5.667±1.033)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

2.2 椎間盤組織病理學(xué)變化及Masuda評分

HE染色結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組椎間盤纖維環(huán)排列紊亂，與NP界限模糊，髓核基質(zhì)凝結(jié)、NP細(xì)胞減少，其Masuda評分(9.800±0.837)較空白組(5.600±1.140)明顯增高(P<0.001)；與模型組比較，扶陽宣痹湯低、中、高劑量組及腰痹通組椎間盤組織病理狀態(tài)均有改善，其中高劑量組與腰痹通組髓核基質(zhì)輕微凝結(jié)、與纖維環(huán)界限清晰、纖維環(huán)紋理較正常，中劑量組(7.200±1.483)、高劑量組(5.800±0.837)與腰痹通組(6.000±1.581)的Masuda評分均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖1 大鼠尾椎間盤的核磁共振檢查

圖2 各組大鼠尾椎間盤的組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×100)

2.3 椎間盤COL2A1及Aggrecan的免疫組化染色

應(yīng)用Image J分析各組COL2A1及Aggrecan平均灰度值，結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組大鼠椎間盤COL2A1及Aggrecan表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，扶陽宣痹湯高劑量組及腰痹通組椎間盤COL2A1和Aggrecan表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，高劑量組與腰痹通組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3-圖4。

圖3 椎間盤二型膠原的免疫組化染色(×400)

圖4 椎間盤蛋白多糖的免疫組化染色(×400)

2.4 椎間盤髓核COL2A1、Aggrecan、MMP9及MMP13的mRNA表達(dá)

與空白組相比，模型組髓核基質(zhì)COL2A1及Aggrecan mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，MMP9及MMP13 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，扶陽宣痹湯高劑量組與腰痹通組的髓核基質(zhì)COL2A1及Aggrecan mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.01)，中、高劑量組和腰痹通組的MMP9及MMP13 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，其中高劑量組與腰痹通組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 COL2A1、Aggrecan、MMP9及MMP13的mRNA表達(dá)

2.5 椎間盤髓核組織MMP9及MMP13的蛋白表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組髓核組織MMP9及MMP13蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，扶陽宣痹湯中、高劑量組及腰痹通組MMP9和MMP13表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)，扶陽宣痹湯中、高劑量組與腰痹通組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖5。

圖5 椎間盤髓核基質(zhì)金屬蛋白酶9、13的蛋白表達(dá)

3 討論

椎間盤是由髓核(Nucleus Pulposus，NP)、纖維環(huán)(Annulus Fibrosus，AF)和軟骨終板組成。髓核組織是一種高水分凝膠狀組織，除NP細(xì)胞外，還有富含COL2A1和Aggrecan的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)。研究表明隨著退行性變的增加，促炎因子大量產(chǎn)生，髓核組織水合作用降低，NP細(xì)胞由于營養(yǎng)不足開始衰老凋亡或表型改變[17]，細(xì)胞凋亡會減少ECM產(chǎn)生，而促炎因子和MMPs又會進(jìn)一步降解現(xiàn)有的ECM，特別是COL2A1和Aggrecan[18]，基質(zhì)成分的改變又使椎間盤的力學(xué)特性不斷喪失，最終形成IDD環(huán)[19]。盡管確切的退變機(jī)制尚存爭議，但COL2A1和Aggrecan等髓核基質(zhì)大分子在維持椎間盤結(jié)構(gòu)與功能完整性方面發(fā)揮著核心作用[20]。筆者已知MMPs能降解ECM中的各種蛋白成分，是組織重塑和膠原降解的主要成分[21]。研究表明暴露于NP細(xì)胞的ECM蛋白水解片段可以導(dǎo)致MMP9、MMP13和Fas基因上調(diào)，COL2A1和Aggrecan基因下調(diào)，進(jìn)而加重IDD[22-23]。另一項研究也發(fā)現(xiàn)IL-1β誘導(dǎo)的IDD在低氧條件下可以通過上調(diào)MMP9、MMP13、ADAMTS4及ADAMTS5的表達(dá)，下調(diào)COL2A1及Aggrecan的表達(dá)來協(xié)同促進(jìn)NP細(xì)胞的分解代謝[24]，這說明MMP9和MMP13與髓核基質(zhì)中的COL2A1及Aggrecan在IDD的退變過程中可能存在密切聯(lián)系。

本實驗通過MRI觀察椎間盤髓核組織及信號變化，發(fā)現(xiàn)模型組信號強(qiáng)度明顯降低，扶陽宣痹湯低、中、高劑量組與模型組相比，信號強(qiáng)度及改良Piffimann椎間盤評分均有改善，其中高劑量組改善明顯。通過HE染色觀察髓核組織，結(jié)果顯示模型組椎間盤纖維環(huán)排列紊亂，與NP界限模糊，NP細(xì)胞減少，而扶陽宣痹湯低、中、高劑量組的椎間盤組織病理學(xué)變化及Masuda評分均有改善，其中、高劑量組改善明顯。以上結(jié)果說明NP細(xì)胞的凋亡可能是加速IDD的重要環(huán)節(jié)，而扶陽宣痹湯在椎間盤退變過程中具有一定的改善作用，并且存在劑量依賴性。另外，與空白組相比，模型組髓核基質(zhì)COL2A1及Aggrecan的mRNA表達(dá)明顯降低，MMP9及MMP13的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)；與模型組相比，扶陽宣痹湯高劑量組及腰痹通組髓核基質(zhì)COL2A1及Aggrecan 的mRNA表達(dá)明顯升高，MMP9及MMP13的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明扶陽宣痹湯可能通過抑制MMP9和MMP13表達(dá)，上調(diào)COL2A1及Aggrecan表達(dá)來穩(wěn)定基質(zhì)合成代謝和分解代謝的平衡，從而緩解或改善退變的椎間盤組織。

中醫(yī)并無“椎間盤退變”這一病名，它所導(dǎo)致的腰椎間盤突出、盤源性腰痛常被歸為“痹癥”“腰痛”等疾病。馬勇教授認(rèn)為“陽氣者，抗力之樞也”，陽氣不足而寒從中生，風(fēng)寒濕邪留滯而氣血凝滯，久而成痹，故臨床常以溫腎陽、除痹痛為治療原則治療此類疾病，并在長期的臨床實踐中形成了扶陽宣痹湯[25]，臨床療效顯著[26-27]。方中附子、桂枝、干姜溫扶一身之陽氣，黃芪補(bǔ)氣實表以行精血津液，雞血藤活血舒筋除痹，川芎、桃仁、當(dāng)歸以行血分，再添之茯苓、生薏苡仁、木香顧護(hù)胃氣，以后天滋先天，共奏扶陽散寒、溫經(jīng)通絡(luò)、通痹止痛之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明附子、黃芪、川芎等具有改善炎性微環(huán)境、改善微循環(huán)、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用[28-30]。

綜上所述，本實驗研究初步發(fā)現(xiàn)扶陽宣痹湯可能通過抑制MMP9及MMP13的生成，上調(diào)COL2A1和Aggrecan的表達(dá)，從而維持椎間盤基質(zhì)合成分解代謝平衡，改善大鼠尾椎間盤退行性病變。但是本實驗中動物模型制備不夠精準(zhǔn)，藥物化合物成分復(fù)雜，且僅從IDD角度探討扶陽宣痹湯的治療作用尚有不足，還有待進(jìn)一步深入研究。